Экспериментальный протокол к уроку 3
Подпишите фломастером микроцентрифужную пробирку (напишите на ней «+» и вашу фамилию)
В
ыньте
две ваши жидкие культуры из качалки
или из термостата и посмотрите на них
при дневном свете и под ультрафиолетом.
Посмотрите, есть ли разница в цвете. С
помощью чистой пипетки перенесите все
содержимое (2 мл) культуральной пробирки,
помеченной «+», в микроцентрифужную
пробирку, которую вы подписали и закройте
ее. Культура, помеченная «-» вам не
понадобится.
Центрифугируйте микроцентрифужную пробирку 5 мин на максимальной скорости. Убедитесь, что вы правильно уравновесили пробирки в центрифуге. Если вы не знаете как правильно это делать, обратитесь к преподавателю.
П осле центрифугирования откройте пробирку и осторожно слейте прозрачную надосадочную жидкость (супернатант). На дне пробирки должен остаться заметный осадок, состоящий из бактериальных клеток.
Посмотрите на осадок под ультрафиолетом. Запишите ваши наблюдения.
Чистой пипеткой добавьте 250 мкл буфера ТЕ в пробирку. Тщательно ресуспендируйте бактериальный осадок, гоняя раствор в пипетке туда-сюда. Не должно остаться ни одного комочка клеток.
И спользуйте промытую пипетку, добавьте 1 каплю лизоцима к ресуспендированному осадку. Закройте пробирку и перемешайте содержимое, встряхивая ее указательным пальцем. Лизоцим начнет расщеплять клеточные стенки бактерий. Пронаблюдайте за пробиркой под ультрафиолетом. Поместите микроцентрифужную пробирку в морозильник до следующего занятия. Замораживание приведет к полному разрушению клеток.
Вопросы к уроку 3
Вы используете бактерий, чтобы наработать зеленый флуоресцентный белок. Назовите функцию оборудования и материалов, которые вы использовали на уроке 3
А. Центрифуга
Б. Лизоцим
В. Морозильная камера
Объясните, почему обе («+» и «-») жидкие культуры флуоресцируют зеленым под ультрафиолетом?
Почему вы отбросили супернатант на этой стадии очистки белка?
4. Объясните, почему бактериальная клеточная стенка рвется при замораживании. (подсказка: что происходит с закрытой бутылкой воды, если ее заморозить?)
5.Какова цель разрушения, или лизиса бактерий?
Урок 4 Вторая стадия очистки: удаление бактериального дебриса
Лизат клеток, который вы приготовили на прошлом занятии, содержит смесь GFP и бактериальных белков. Ваша цель состоит в том, чтобы отделить и очистить зеленый флуоресцентный белок от других белков. Белки – это длинные цепи из аминокислот, некоторые из которых очень гидрофобные («боящиеся воды», жирные). В составе GFP содержится много гидрофобных участков ,и в целом они делают белок очень гидрофобным. GFP намного более гидрофобен, чем большинство бактериальных белков. Мы можем использовать это свойство GFP чтобы отделить его от менее гидрофобных (более гидрофильных, «любящих воду») бактериальных белков.
Хроматография это мощное средство разделения белков и других молекул в сложных смесях, и оно обычно используется в биотехнологии для очистки рекомбинантных белков. При хроматографии раствор белка проходит сквозь колонку, набитую сорбентом, состоящим из микроскопических шариков.
Метод, который вы будете использовать, называется гидрофобной хроматографией. Микроскопические шарики, из которых состоит сорбент, в этом методе сделаны очень гидрофобными, «жирными». Когда клеточный лизат в высокосолевом растворе протекает на колонку, гидрофобные («жирные») белки прилипают к сорбенту и остаются на нем, в то время как остальные белки не задерживаются. Когда концентрация соли понижается, даже гидрофобные белки больше не могут взаимодействовать с колонкой и смываются с нее в чистом виде.
Контрольный список () для ежедневной подготовки рабочих мест
Ваше рабочее место
Проверьте, что на вашем столе есть все нижеперечисленные расходные материалы и приборы перед началом работы.
Рабочее место учителя (общее)
Список расходных материалов и оборудования, которые должны лежать в общем месте, доступном всем ученикам, также приведен ниже.
Урок 4 |
|
Рабочие места учеников |
Число/на пару |
Микроцентрифужные пробирки |
1 |
Пипетки |
1 |
Штатив для микроцентрифужных пробирок |
1 |
Фломастер |
1 |
Стакан с водой для промывания пипеток |
1 |
Колонка для гидрофобной хроматографии |
1 |
Крышка для колонки |
1 |
Рабочее место учителя |
|
Буфер для связывания |
1 бутылка |
Буфер для уравновешивания |
1 бутылка |
Центрифуга |
1 |
УФ лампа |
1-4 |