Разлейте жидкую питательную среду

Взяв чистую пипетку, разлейте по 2 мл среды в 16 пробирок (добавьте два раза по 1 мл). Храните эти пробирки со средой в холодильнике до тех пор, пока они вам не понадобятся. В наборе содержатся девять дополнительных пробирок. Вы можете наполнить их средой и использовать в демонстрационных целях или как запасные для тех учеников, у которых что-то не получится.

Для урока 2, каждой паре понадобятся две культуральные пробирки, по 2 мл жидкой питательной среды в каждой. В этом уроке ученики инокулируют их 2 мл культуры трансформантами из набора по трансформации бактерий pGLO.

Замечение: в идеале, культуры должны выращиваться сутки при температуре 32º и перемешиваться в режиме 40-200 об/мин. Перемешивание способствует поступлению кислорода в среду к делящимся клеткам, и чем оно лучше, тем лучше клетки растут. Обычно для этого используется микробиологическая качалка. Можно также плотно закрыть пробирки и поместить их на шейкер внутрь обычного термостата, установленного на 32º. Если такие приборы недоступны, культуры клеток можно встряхнуть вручную в течение 30 сек и потом растить сутки на 32º. Просто пусть ваши ученики потрясут культуры в течение 30 секунд так, как бы они встряхивали баллончик с краской. Чем интенсивнее будет встряхивание, тем лучше будет рост клеток и тем больше GFP образуется. После встряхивания положите пробирки набок внутрь термостата, установленного на 32º на 1-2 дня. Когда пробирки расположены горизонтально, большая поверхность среды находится в контакте с воздухом, что увеличивает диффузию кислорода внутрь клеток. Периодически встряхивайте пробирки в течение двухдневной инкубации.

Если термостата нет, клетки за два дня вырастут и при комнатной температуре. Однако в этом случае надо использовать качающуюся платформу или шейкер. Не рекомендуется растить культуры без перемешивания при комнатной температуре. После требуемого инкубационного периода, культуры инокулированные белыми и зелеными колониями должны выглядеть ярко-зелеными под ультрафиолетовым светом.

Урок 3 Первая стадия очистки: концентрирование и лизис бактерий

Предварительная подготовка

Задачи	Подготовить рабочие места
	Растворить лизоцим
	Подготовить центрифугу
Требуемое время	10 минут

Растворите содержимое флакона с лизоцимом, добавив туда 1 мл ТЕ чистой пипеткой. Аккуратно перемешайте. Сохраняйте раствор на льду или в холодильнике до использования.

Урок 4 Вторая стадия очистки: удаление бактериального дебриса

Задачи	Подготовить рабочие места (единственная требуемая подготовка)
	Подготовить центрифугу
Требуемое время	10 минут

Урок 5 Третья стадия очистки: хроматография белка

Задачи	Подготовить рабочие места (единственная требуемая подготовка)
Требуемое время	10 минут

Если колонки высохли, они могут быть легко регидратированы следующим образом: вылейте смолу в стаканчик или другой подходящий сосуд и добавьте воду так, чтобы получилась суспензия. Потом перелейте суспензию обратно в колонку. Слейте воду и уравновесьте колонку буфером для связывания.

Важные разделы уроков

В этой секции описаны шаги, которые могут вызывать затруднения, или шаги, которые являются чрезвычайно важными для получения результата и для общего понимания всех экспериментов. Преподаватели должны обратить внимание своих учеников на эти вопросы и ,если это возможно, продемонстрировать выполнение процедуры, перед тем, как ученики попробуют это сделать сами. Руководство для учеников содержит подробные картинки и описание всех экспериментальных шагов и процедур для уроков со второго по пятый. Обращайтесь к нему если вам что-то непонятно в экспериментальных протоколах.

Использование пипетки

Перед началом лабораторных занятий, покажите ученикам градуировки на пипетке. В качестве единицы измерения в течение работы будет применяться как 250 мкл так и 1 мл

Урок 1 Обзор генетической трансформации

Питательная среда

Жидкая и агаризованная среда LB (Лурия-Бертани) сделана из дрожжевого экстракта и гидролизата мясных субпродуктов и представляет собой смесь углеводов, аминокислот, нуклеотидов, солей и витаминов, необходимых для роста бактерий. Агар, который производится из водорослей, расплавляется при нагревании, а когда остывает, образует твердый гель, напоминающий желе. Он функционирует в качестве подложки, на которой растут бактерии.

Отбор на устойчивость к антибиотикам

Плазмида pGLO, содержащая ген зеленого флуоресцентного белка, также содержит ген бета-лактамазы, фермента, дающего бактериям устойчивость к антибиотику ампициллину. Бета-лактамаза производится и выбрасывается наружу бактериями, содержащими плазмиду. Секретированная бета-лактамаза инактивирует ампициллин, что позволяет только трансформированным клеткам расти в его присутствии (См. схему ниже).

Регуляция генов

Одна из самых важных концепций набора по трансформации бактерий pGLO это концепция регуляции работы генов. В этом наборе бактерии, трансформированные плазмидой pGLO высевались на чашки LB/amp и LB/amp/ara. Экспрессия зеленого флуоресцентного белка находится под контролем арабинозного промотора. Таким образом, когда бактерии высевались на среду, содержащую арабинозу (LB/amp/ara) экспрессировался GFP и колонии выглядели ярко-зелеными. Напротив, когда бактерии высевались на среду без арабинозы (LB/amp) ген выключался и колонии были белыми (см. Приложение D для дополнительных деталей).

Эта тема развивается дальше в этом наборе. Если взять белую колонию (которая содержит ген GFP, но не экспрессирует его в отсутствие арабинозы) и инокулировать жидкую среду LB/amp/ara, присутствующая в среде арабиноза будет поглощаться клетками и ген GFP заработает. Таким образом, ученики сеют белую колонию со спящим геном GFP в среду ,содержащую арабинозу, она включает ген и культура приобретает способность светиться зеленым. В дополнение ученики сеют зеленую колонию в жидкую среду LB/amp/ara, в этом случае ген остается активным и жидкая культура также будет светиться ярко-зеленым.

Урок 2 Инокуляция и выращивание бактериальной культуры

Выбор одиночных бактериальных колоний

На этом этапе ученики должны выбрать одну белую колонию с чашки LB/amp и одну зеленую колонию с чашки LB/amp/ara для параллельного выращивания в жидких культурах.

Клонирование описывает изолирование и размножение одного гена. Так как одна бактериальная колония происходит от одной клетки, все бактерии в составе колонии генетически идентичны и называются клонами. Когда ученики выбирают колонии (или клоны) белых и зеленых бактерий с чашки, они выбирают отдельные колонии для переноса в жидкую среду. Отдельные колонии, находящиеся на расстоянии как минимум 1-2 мм от других колоний на чашке как правило не загрязнены другими бактериями. Схема, приведенная ниже, поясняет экспрессию генов в зеленых колониях.

Преподаватель может показать как выбрать отдельную изолированную колонию и снять ее с агара, используя микробиологическую петлю. Очень важно, чтобы при отборе колоний и посеве в среду использовалась техника стерильной работы. Напоминайте ученикам о необходимости держать чашки и пробирки закрытыми всегда, когда это возможно.