Biotechnology Explorer

Набор для очистки зеленого флуоресцентного белка (GFP)

Учебное руководство

Полный курс обучения

Наборы и учебные материалы Biotechnology Explorer разрабатываются в течение последних пяти лет учителями и для учителей. Они проходят проверку в самых разных условиях от школ до ВУЗов. Простые в использовании наборы Biotechnology Explorer - это лучший способ познакомить класс с современными достижениями в области биотехнологий. Каждый набор содержит пошаговую инструкцию и может быть использован и опытными и начинающими преподавателями.

Учебные материалы, содержащиеся в каждом наборе, делают наши продукты уникальными. Каждый набор содержит индивидуальный учебный комплект, разделенный на две части: руководство для преподавателей и руководство для учеников. Материалы для учителей содержат три секции, помогающие обеспечить гладкое протекание лабораторной работы. Первая секция содержит вводную информацию, темы, которые необходимо затронуть и ссылки, которые позволят как более опытным, так и начинающим преподавателям подготовить уроки и лекции, предшествующие лабораторной работе. Хорошая заранее проведенная подготовка является гарантией отсутствия проблем во время самой работы и гарантией того, что ученики поймут идеи, лежащие в ее основе.

Вторая секция описывает подготовку к экспериментальной части. Подробные описания всех шагов и рисунки практически исключают возможность совершения ошибки. Помимо того, в этой секции дана информация по времени выполнения различных шагов, которая поможет вам спланировать ваше расписание. Каждая лабораторная работа может быть выполнена за 50 мин, что укладывается в большинство возможных расписаний.

В третьей секции вы сможете найти подробные ответы на вопросы, содержащиеся в руководстве для учеников. Учитель может руководствоваться этими ответами, оценивая ответы своих учеников.

Каждый набор создан для того, чтобы максимально вовлечь ученика в работу и в вопросы, задаваемые в учебных материалах. Вовлечение учеников в процесс позволяет привить им ценности научного подхода и организованного и логического способа решать задачи. У учеников, прошедших курсы Biotechnology Explorer возникает чувство понимания научных методов.

Для того, чтобы ваши ученики получили как можно больше от этой лабораторной работы, они должны знать, что такое ген и понимать взаимосвязь между генами и белками. Более подробное обсуждение этой и других основных концепций молекулярной биологии вы сможете найти в приложении B.

Мы пытаемся постоянно улучшать наши учебные материалы и продукты. Ваше участие очень важно для нас. Ваши идеи, комментарии и предложения позволят вам сделать наши продукты еще большим подспорьем в преподавании.

Содержание

Руководство для преподавателей 4

Контрольный список() содержания набора 4

Вопросы безопасности 6

Предполагаемый план уроков 7

Общий план подготовки для учителей 7

Контрольный список () для ежедневной подготовки рабочих мест 7

Подготовка преподавателей к лабораторной работе 9

Урок 2 Инокуляция и выращивание бактериальной культуры 9

Урок 3 Первая стадия очистки: концентрирование и лизис бактерий 12

Урок 4 Вторая стадия очистки: удаление бактериального дебриса 12

Урок 5 Третья стадия очистки: хроматография белка 12

Важные разделы уроков 12

Урок 1 Обзор генетической трансформации 13

Урок 2 Инокуляция и выращивание бактериальной культуры 14

Урок 3 Первая стадия очистки: концентрирование и лизис бактерий 16

Урок 4 Вторая стадия очистки: удаление бактериального дебриса 17

Урок 5 Третья стадия очистки: хроматография белка 17

Очистка GFP - краткое руководство в картинках 20

Ответы на вопросы для преподавателей 24

Руководство для учеников 29

Урок 1: поиск светящейся зеленым молекулы 29

Урок 2: инокуляция и выращивание бактериальной культуры 30

Урок 3 Первая стадия очистки: концентрирование и лизис бактерий 33

Урок 4 Вторая стадия очистки: удаление бактериального дебриса 36

Урок 5 Третья стадия очистки: хроматография белка 39

Приложение А 44

Приложение B 47

Приложение С 53

Приложение D 53

Найти иголку в стоге сена легче, если она светится

Это лабораторная работа рассчитана на то, чтобы быть выполненной вслед за работой по трансформации бактерий плазмидой pGLO. Трансформированные бактерии, производящие зеленый флуоресцентный белок (Green Fluorescent Protein, GFP) засеваются с чашек в питательную среду. Затем бактериальные клетки вскрываются (лизируются) высвобождая содержащийся в них GFP. Белок очищается от бактериального дебриса с помощью одноразовых хроматографических колонок, содержащихся в этом наборе. Способность GFP к флуоресценции позволяет наглядно наблюдать за всем процессом выделения.

Одно из главных средств современной биотехнологии – рекомбинация ДНК, разрезание и сшивание разных молекул ДНК друг с другом. Основная идея заключается в том, чтобы вырезать фрагмент ДНК (ген) из одного организма и соединить его с ДНК другого организма-реципиента. Таким образом, реципиент будет нести генетические инструкции, содержащиеся в приобретенном фрагменте ДНК. Например, в растения могут быть встроены гены, придающие им устойчивость к вредителям или болезням, и на сегодняшний день известно несколько случаев, когда функциональные гены были доставлены людям с нефункциональными (мутированными) генами, например, больным муковисцидозом.

Гены могут быть вырезаны из ДНК людей, животных или растений и перемещены в бактерии. Например, ген человеческого гормона инсулина может быть помещен в бактерию. В определенных условиях такие бактерии способны вырабатывать инсулин. Выращивание бактерий в гигантских чанах (ферментерах) позволяет производить инсулин в промышленных масштабах. Такой «рекомбинантный» инсулин очищается с помощью белковой хроматографии и используется для лечения больных диабетом, генетическим нарушением, при котором не вырабатывается инсулин.

Распространенная проблема при выделении рекомбинантных белков из бактерий это загрязнение бактериальными белками. Для очистки интересующих нас белков и отделения их от бактериальных в промышленности применяется мощный инструмент – хроматография. Белки, очищенные таким способом, используются в медицине и в быту, как например ферменты в составе стиральных порошков.

Клонирование и экспрессия гена GFP и следующая за ним процедура выделения белка полностью аналогичны процедурам, применяющимся в промышленности для выделения и очистки коммерчески важных белков. Природным хозяином гена зеленого флуоресцентного белка является медуза Aequoria victoria.

«Рекомбинантная ДНК была самым ценным по весу материалом в мире. Одна-единственная микроскопическая бактерия, невидимая невооруженным глазом, но несущая в себе ген фермента стрептокиназы, помогающего при инфаркте, или ген устойчивости злаков к заморозкам могла стоить 5 миллиардов долларов, если найти правильного покупателя» - Майкл Крихтон «Парк Юрского периода»

Руководство для преподавателей

Контрольный список() содержания набора

В этом разделе перечислены все компоненты, входящие в состав набора по очистке зеленого флуоресцентного белка и требуемые дополнительные принадлежности. Каждый набор рассчитан на восемь рабочих мест для учеников. Проверьте с помощью этого списка, все ли у вас есть, перед тем как начать работу.

Компоненты в составе набора	Число/на один набор	()
Ампициллин, лиофилизованный	1 флакон	
Арабиноза, лиофилизованная	1 флакон	
Сухая среда LB (на 50 мл среды)	1 таблетка	
Микробиологические петли, упаковки по 10 петель	2 упаковки	
Стерильные пипетки в индивидуальной упаковке	40	
Микроцентрифужные пробирки, 2.0 мл, прозрачные	30	
Культуральные пробирки, 15 мл, стерильные (упаковка 25 шт)	1 упаковка	
Пробирки для сбора фракций, 5 мл, полистирол	25	
Буфер TE (10 mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0)	1 бутылка	
Лизоцим, лиофилизованный	1 флакон	
Буфер для связывания (4M NH4SO4/TE, pH 8.0)	1 бутылка	
Буфер для уравновешивания колонки (2M NH4SO4/TE, pH 8.0)	1 бутылка	
Буфер для промывки колонки (1.3M NH4SO4/TE, pH 8.0)	1 бутылка	
Колонки для гидрофобной хроматографии	8 колонок	
Крышки для колонок	1 пакет	
Необходимые дополнительные принадлежности	Число/на класс	()
Чашки с трансформантами (из набора по трансформации бактерий pGLO LB/amp и LB/amp/ara)	2	
УФ лампа, длинноволновая	1-4	
Центрифуга	1	
Микроволновая печь	1	
Колба на 250 мл	1	
Градуированный цилиндр на 100 мл	1	
Дистиллированная вода	100 мл	
Стакан с водой для промывания пипеток	1	
Фломастеры	8	
Морозилка	1	
Штативы для микроцентрифужных пробирок	8	
Опциональные компоненты
Микробиологическая качалка или шейкер. Использование качалок ускорит рост бактерий в жидкой культуре, но не является обязательным.	1	
Термостат	1	
Коробки для хранения микроцентрифужных пробирок	8	

Вопросы безопасности

Штамм Escherichia coli HB101 K-12 входящий в состав этого набора это не патогенный микроорганизм (в отличие от штамма E. coli H157:07 иногда вызывающего пищевые отравления). HB101 K-12 генетически модифицирован так, чтобы расти только на специальной обогащенной среде. Тем не менее, обращение с этим штаммом требует соблюдения стандартных микробиологических процедур. Эти процедуры с необходимостью включают в себя (но не ограничиваются) следующим: раз в день или при разлитии биологического материала все рабочие поверхности обеззараживаются; все зараженные жидкие или твердые отходы обеззараживаются перед утилизацией; все ученики и преподаватели должны мыть руки после каждого контакта с содержащего бактерии материалом и перед выходом из лаборатории. Все процедуры должны выполняться аккуратно, чтобы не вызывать возникновения аэрозолей. Для пользования пипеткой должны применяться механические устройства, набирать растворы ртом запрещено. Запрещено есть, пить, курить и пользоваться косметикой в рабочем помещении. Рекомендуется использование защитных очков и перчаток.

При отсутствии автоклава, все растворы и принадлежности (петли и пипетки), входившие в контакт с бактериями, помещаются по меньшей мере на 20 мин в 10% раствор хлорки для стерилизации. Ванночка с таким раствором должна стоять в каждом рабочем помещении. Все использованные петли и пипетки должны быть собраны для стерилизации. Для стерилизации чашек Петри они покрываются сверху 10% раствором хлорки и выдерживаются как минимум час, после этого жидкость выливается в канализацию, а чашки заворачиваются и далее рассматриваются как обычный мусор. При работе с раствором хлорки рекомендуется использование защитных очков.

Ампициллин может вызывать аллергические реакции или раздражение глаз, дыхательных путей и кожи. В случае попадания в глаза, немедленно промойте их большим количеством воды и обратитесь за медицинской помощью. Используйте подходящие средства защиты. Ампициллин является антибиотиком семейства пенициллина, если у кого-то есть аллергия на пенициллин или на другой пенициллиновый антибиотик, он должен избегать контакта с ампициллином.

Более подробную информацию и данные по безопасности (MSDS) для компонентов набора вы можете узнать на сайте компании www.bio-rad.com. Используйте ваши местные законы и нормативы для правильной утилизации отходов.

УФ лампа

Ультрафиолетовое излучение может вызывать ожоги глаз и кожи. Коротковолновое УФ-излучение более опасно, чем длинноволновое. Используйте длинноволновую УФ лампу для этой работы. Если возможно, используйте защитные очки, не пропускающие УФ (обычное кварцевое стекло также задерживает УФ).

Предполагаемый план уроков

Учебный курс по очистке зеленого флуоресцентного белка включает 5 уроков, в том числе четыре экспериментальных занятия. Каждый урок рассчитан на 50 минут. Для непрерывного протекания работы, ее можно начать в понедельник и закончить в пятницу. Пошаговые инструкции по выполнению экспериментов приведены в руководстве для учеников.

Урок 1 Введение, лекция и обсуждение

Урок 2 Выбор колоний и инокуляция бактериальных культур

Урок 3 Первая стадия очистки: концентрирование и лизис бактерий

Урок 4 Вторая стадия очистки: удаление бактериального дебриса

Урок 5 Третья стадия очистки: хроматография белка

Общий план подготовки для учителей

В этой секции приведен рекомендуемый план подготовки для учителей. Подробное описание подготовки экспериментов начинается по страницы 6.

Что нужно сделать	Когда	Сколько потребуется времени
Прочитать руководство	Немедленно	1 час
Приготовить жидкую среду	Перед началом урока 2	15 минут
Подготовить рабочие места	Перед началом каждого урока	5 минут

Контрольный список () для ежедневной подготовки рабочих мест

Рабочие места учеников

Ниже приведены приборы и расходные материалы, которые должны быть на каждом рабочем месте перед началом каждой экспериментальной работы. Компонентов в составе этого набора достаточно для снабжения 8 рабочих мест.

Рабочее место учителя (общее)

Список расходных материалов и оборудования, которые должны лежать в общем месте, доступном всем ученикам, также приведен ниже. На усмотрение учителя решать, будут ли ученики иметь доступ к общим буферным растворам и оборудованию, или он сам будет отливать требуемые количества растворов и работать с оборудованием.

Урок 2
Рабочие места учеников	Число/на пару
Чашки с трансформантами из набора по транформации бактерий pGLO (LB/amp и LB/amp/ara)	2
Микробиологические петли	2
Культуральные пробирки, содержащие по 2 мл жидкой среды	2
Фломастер	1
Штатив для микроцентрифужных пробирок	1-4
Рабочее место учителя
Микробиологическая качалка или шейкер (необязательно)	1
УФ-лампа	1-4

Урок 3
Рабочие места учеников	Число/на пару
Микроцентрифужные пробирки	1
Пипетки	1
Штатив для микроцентрифужных пробирок	1
Фломастер	1
Стакан с водой для промывания пипеток	1
Рабочее место учителя
Буфер ТЕ	1 бутылка
Лизоцим (регидратированный)	1 флакон
Центрифуга	1
УФ-лампа	1-4

Урок 4
Рабочие места учеников	Число/на пару
Микроцентрифужные пробирки	1
Пипетки	1
Штатив для микроцентрифужных пробирок	1
Фломастер	1
Стакан с водой для промывания пипеток	1
Колонка для гидрофобной хроматографии	1
Крышка для колонки	1
Рабочее место учителя
Буфер для связывания	1 бутылка
Буфер для уравновешивания	1 бутылка
Центрифуга	1
УФ лампа	1-4

Урок 5
Рабочие места учеников	Число/на пару
Пробирки для сбора фракций	3
Пипетки	1
Штатив для микроцентрифужных пробирок	1
Фломастер	1
Стакан с водой для промывания пипеток	1
Колонка для гидрофобной хроматографии	1
Крышка для колонки	1
Рабочее место учителя
Буфер ТЕ	1 бутылка
Буфер для промывки	1 бутылка
Буфер для уравновешивания	1 бутылка
УФ-лампа	1-4