2. Материалы и методы

Для молекулярного моделирования использовались 3D структуры оксигемоглобина A₁ (код pdb 1hho) и дезоксигемоглобина (код pdb 2hhb) человека полученные методом рентгеноструктурного анализа. Из указанных структур были удалены молекулы воды и фосфат-ионы и в дальнейших расчетах учитывались только координаты атомов белковой части и гемов дезокси- и оксигемоглобина. 3D структуры лигандов Ар₄А (b4p_repr.pdb) получены из базы данных низкомолекулярных органических соединений HIC-Up (Университет Упсала, Швеция). Молекулярное моделирование комплекса HbA₁ с Ар₄А проводили с помощью программы GRAMM (версия 1.03).

2.1. Моделирование в программе gramm

Программа Gramm (The Global Range Molecular Matching) позволяет проводить молекулярный докинг белков. Для того чтобы предсказать структуру комплекса, требуются только координаты атомов двух молекул (информация о связывающих участках не требуется). Программа выполняет исчерпывающий 6-мерный поиск посредством параллельного переноса и вращения молекул. Молекулярными парами могут быть: два белка; белок (рецептор) и малая молекула (лиганд); две трансмембранные спирали.

Gramm может использоваться для докинга молекул с высокой разрешающей способностью (high-resolution docking) и для молекул, где известны только крупные структурные особенности (low-resolution docking).

Программа Gramm позволяет сглаживать энергию межмолекулярных взаимодействий, изменяя диапазон потенциалов между двумя атомами. Программа с различной точностью позволяет определять местонахождение области глобального минимума межмолекулярной энергии в структурах. Качество предсказания зависит от точности самих структур. Таким образом, докинг структур с высокой разрешающей способностью и с небольшими конформационными изменениями приводит к точному предсказанию положения молекул в комплексе, в то время как докинг структур с низкой разрешающей способностью дает только приблизительное относительное положение взаимодействующих компонентов в комплексе.

2.2 Визуализация и преобразование координат

Для визуализации и преобразования координат атомов использовали программу Netscape Communicator (версия 4.5). Данная программа позволяет просматривать изображения молекул в формате pdb.

Рис. 6. Интерфейс программы Netscape Communicator.

При помощи Netscape Communicator макромолекулы можно представить в различных вариациях. Также в данной программе предусмотрен выбор цветов для отдельных групп атомов, которые составляют макромолекулу.

3. Результаты и обсуждение

Изучение взаимодействия рецептора с лигандом проводится с помощью компьютерного моделирования с привлечением молекулярного докинга. Обычно молекула рецептора представляет собой белковую макромолекулу, а молекула лиганда – низкомолекулярное соединение. В данной работе проводилось моделирование комплексов дезокси- и оксигемоглобина с Ар₄А. При этом использовалась программа молекулярного докинга Gramm.

3.1. Базовые операции проводимые в программе gramm

Protein Data Bank (PDB) является хранилищем для 3D структур крупных биологических молекул, таких, как белки и нуклеиновые кислоты. Эти данные, как правило, получены методами рентгеновской кристаллографии и ЯМР-спектроскопии.

Все файлы, использованные в работе, имеют расширение pdb. В них содержатся данные о координатах атомов, аминокислотной последовательности и цепях белковой молекулы. Также каждый атом имеет дополнительную информация о тепловом факторе и вероятности нахождения атома в точке пространства, определенной данными координатами. Так, например, файл w.pdb, отражающий одну из конформаций Ар₄А, выглядит следующим образом:

Программа Gramm содержит три файла, считывание которых способствует построению комплексов между молекулами: rpar.gr, rmol.gr, wlist.gr.

Рабочие параметры для проведения молекулярного докинга считываются программой из файла rpar.gr и корректируются вручную (рис. 6, табл. 1)

Рис. 7. Файл rpar.gr

Таблица 1. Параметры моделирования, использующиеся в программе Gramm

Параметр	Характеристика
mmode	Определяет способ докинга: общий (generic) или спираль (helix). При выборе команды generic, Gramm пытается учесть все положения лиганда и ориентацию. При выборе команды helix − автоматически не рассматривает конфигурации с большим смещением вдоль оси спирали и углами между спиралями. Это упрощает анализ результата и экономит время вычислений
eta	Шаг сетки
ro	Отталкивание атомов. Измеряется в произвольных единицах (притяжение равно -1)
fr	Притяжение двойного диапазона. Используется только при докинге с высокой разрешающей способностью
crang	Два типа диапозонов. Команда atom_radius – стыковка происходит с учетом ван-дер-вальсовых взаимодействий между атомами. Применяется только при high resolution docking. Команда grid_step (сетка хода) применяется при low resolution docking
ccti	Отображение. Может быть черно-белое (blackwhite), либо серое (gray)
crep	Команда all осуществляет докинг с учетом всех взаимодействий между атомами, а hydrophobic – учитывает только гидрофобные взаимодействия между атомами – гидрофобный докинг
maxm	Указывает число вывода данных
ai	Угол вращения

В файл rmol.gr помещаются основные характеристики, используемые при расчете: адреса файлов с координатами белка и лиганда, фрагменты и цепи структур, используемые при расчетах, идентификационные имена. Затем они считываются программой.

Рис. 8. Файл rmol.gr

Управление программой Gramm осуществляется из командной строки с использованием двух типов команд: gramm scan для запуска процесса докинга и gramm coord для построения результирующих файлов с координатами комплекса. По окончанию процесса моделирования программа выдает результат в виде файла с расширением *.res, названный с использованием идентификационных имен изучаемых молекул.

Программа Gramm не имеет собственных средств визуализации биологических молекул. Однако, в нее встроена функция преобразования координат подвижной молекулы докинга в соответствии с определенными ранее параметрами. Данная функция задается командой gramm coord, причем пользователь имеет возможность выбора оптимальных параметров для преобразования координат. Выбранные нами оптимальные случаи для преобразования считываются программой из файла wlist.gr.

Рис. 9. Файл wlist.gr

В зависимости от заданных параметров в wlist.gr файле результирующие координаты получаются либо виде отдельных pdb-файлов для каждого варианта комплекса, либо виде одного, содержащего все запрошенные структуры.