1. Взаимодействие тетрамеров гемоглобина с отрицательно заряженными эффекторами: молекулярный докинг (аналитический обзор)

1.1 Структура гемоглобина

Гемоглобин человека (HbA₁) представляет собой тетрамерный белок, состоящий из двух - и двух -субъединиц, включающих 141 и 146 аминокислотных остатков, соответственно. Вторичная структура -субъединиц характеризуется наличием семи -спиралей, обозначаемых символами A, B, C, E, F, G, H, а также восьми неспирализованных участков: NA, AB, BC, CЕ, EF, FG, GH, HC. В состав -субъединиц входят восемь -спиралей A, B, C, D, E, F, G, H и девять неспирализованных участков: NA, AB, BC, CD, DE, EF, FG, GH, HC. Как правило, в участках разделяющих -спиральные сегменты, образуются изгибы полипептидной цепи (рис. 1). Особенностью F-спирали обеих субъединиц является наличие в ней двух спирализованных участков – F' и F. Межспиральные участки отличаются относительной неупорядоченностью, поскольку некоторые из них являются элементами других видов вторичной структуры, например π-спирали (участок FG1-FG3). Согласно данным рентгеноструктурного анализа, молекула гемоглобина по своей форме приближается к сфере с диаметром 5,5 нм.

Рис. 1. Структура гемоглобина

Химически гемоглобин относится к группе сложных белков – хромопротеидов, состоящих из белковой части – апоглобина и связанного с ней окрашенного небелкового компонента – гемма. Основу структуры простетической группы большинства гем-содержащих белков составляет протопорфириновое кольцо (рис. 2), построенное из пиррольных групп. Четыре пиррола соединяются между собой метиновыми мостиками (–СН=), образуя тетрапиррольное кольцо. Незамещенный порфирин называется порфином. В результате присоединения к нему четырех метильных групп (–СН₃), двух винильных групп (–СН=СН₂) и двух остатков пропионовой кислоты образуется молекула протопорфирина (рис. 2). Несмотря на возможное существование 15 вариантов пространственного расположения данных заместителей в биологических системах присутствует только один из изомеров, получивший название протопорфирин IX (рис. 2).

а) б)

Рис. 2. Строение простетической группы гемоглобина. а) – протопорфирин IX (1,3,5,8-тетраметил-2,4-дивинил-6,7-дипропионовокислый порфин); б) – гем.

Атом железа в геме может находиться либо в высокоспиновой (без лиганда), либо в низкоспиновой (в присутствии лиганда) ферро-(Fe⁺²) форме, образуя, соответственно, либо пять, либо шесть координационных связей. Четыре координационные связи атом железа образует с атомами азота порфиринового кольца, пятую – с ε-азотом (N_ε) имидазольного кольца проксимального гистидина F8 (His87 или His). Шестое координационное положение в оксигемоглобине занимает лиганд [1], представленный молекулой О₂. В качестве лигандов в гемоглобине могут выступать СО, цианиды, нитросоединения и др.

В зависимости от химической природы заместителей в порфирине их подразделяют на этио-, мезо-, копро- и протопорфирины. Как было указано выше, последние имеют наибольшее распространение в природе.

Аминокислотные последовательности - и -цепей различаются примерно на 50%, что в свою очередь практически не сказывается на сходстве принимаемых ими трехмерных структур [2].

Олигомеризация - и -субъединиц с образованием тетрамерной молекулы гемоглобина (₂₂) происходит через промежуточную стадию димеризации () за счет формирования ван-дер-ваальсовых контактов и водородных связей между рядом аминокислотных остатков спиралей B, H, G обеих субъединиц и, дополнительно, D-спирали -субъединицы. При этом участок B-спирали одной субъединицы взаимодействует с участком H-спирали другой, в то время как G-спирали обеих субъединиц взаимодействуют друг с другом. Ряд аминокислотных остатков, расположенных в начале D-спирали -субъединицы образуют дополнительные контакты с H-спиралью -субъединицы [5б]. В молекуле гемоглобина димеры  взаимодействуют друг с другом, образуя тетраэдрическую четвертичную структуру, которая поддерживается многочисленными контактами между димерами в интерфейсах ₁₂, ₂₁, ₁₂ и ₁₂ [3].

При ассоциации субъединиц в четверичную структуру внутри молекулы белка формируется центральная полость, имеющая форму цилиндра и направленная вдоль оси интерфейсов ₁₂ и ₁₂. Одна часть цилиндра проходит в области контакта -субъединиц друг с другом и является наиболее узкой, вторая часть расположена в области контакта -субъединиц. В этом участке центральная полость расширяется и на конце цилиндра формируется симметричный кластер, включающий радикалы ряда положительно-заряженных аминокислот, а также аминогруппы N-концевых валинов -субъединиц. Данный кластер представляет собой сайт связывания аллостерического регулятора гемоглобина человека – 2,3-дифосфоглицерата (DPG) [4].

1.1.1 R↔T-переходы гемоглобина в реакциях оксигенации/дезоксигенации

Оксигенация молекулы гемоглобина индуцирует изменения третичной и четвертичной структур данного белка, которые сопровождаются постепенным увеличением сродства гемопротеида к лиганду, т.е. О₂. В 1965 году Моно, Уаймен и Шанжё предложили общую модель для объяснения кооперативных и аллостерических явлений (MWC-модель). Они постулировали, что белки, обнаруживающие кооперативные эффекты, содержат несколько симметрично расположенных субъединиц, принимающих как минимум два конформационных состояния, обозначаемых как Т (напряженное) и R (релаксированное). Согласно этой модели гемоглобину соответствуют две альтернативные конформации: Т – в дезокси-состоянии и R – в полностью оксигенированном (лигандированном) состоянии. Указанные состояния отличаются взаимным расположением субъединиц, а также числом и силой взаимодействия между ними.

Перестройка третичной структуры включает в себя изменения положения гема, атома железа относительно порфиринового кольца, гемового окружения. «Переключение» четвертичной структуры заключается в изменении положения αβ-димеров друг относительно друга, сопровождающееся перестройками в α₁β₂ и α₂β₁ интерфейсах, а также разрывом характерных для Т-структуры солевых мостиков.

Таким образом, благодаря разрыву стабилизирующих Т-структуру солевых мостиков и конформационным перестройкам в α₁β₂- и α₂β₁-интерфейсах происходит изменение взаимного расположения α₁β₁- и α₂β₂-димеров. При этом димеры поворачиваются друг относительно друга на 13,2º и смещаются по направлению друг к другу на 1,4 Å (рис. 3). Это приводит к значительному уменьшению размера центральной полости тетрамерной молекулы гемоглобина.

Рис. 3. Изменение конформации гемоглобина при его оксигенации

Иными словами, оксигенация гемоглобина вызывает изменение его четвертичной структуры, т.е. способа упаковки субъединиц. В результате молекула оксигемоглобина приобретает несколько более компактную структуру по сравнению с дезоксигемоглобином. Связывание О₂ сопровождается разрывом солевых мостиков, образованных концевыми карбоксильными группами субъединиц. Это облегчает связывание следующих молекул О₂. Поскольку при этом требуется разрыв меньшего числа солевых связей.

Рис. 4. Солевые мостики между субъединицами в дезоксигемоглобине. При оксигенировании эти нековалентные связи, обусловленные электростатическими взаимодействиями, разрушаются.