Модификация cтруктуры-лидера в ряду -лактамных антибиотиков

А) Методы получения полусинтетических пенициллинов

Бензилпенициллин и созданные на его основе многочисленные лекарственные формы отличаются наиболее высокой химиотерапевтической эффективностью и наименьшей токсичностью. Однако -лактамный цикл бензилпенициллина легко разрушается под действием фермента пенициллиназы (-лактамазы), продуцируемой многими микроорганизмами. Эти обстоятельства послужили предпосылкой создания полусинтетических пенициллинов. Решение такой сложной проблемы стало возможным после выделения 6-аминопенициллановой кислоты (I, 6-АПК), являющейся «ядром» пенициллина. Получают 6-АПК из бензилпенициллина (или других пенициллинов), воздействуя ферментом пенициллинацилазой, продуцируемым бактериями (реже используют химические методы расщепления (кислотный гидролиз) пенициллинов до 6-АПК, схема 1). На основе 6-АПК синтезировано большое количество полусинтетических пенициллинов, представляющие собой ацильные производные. В качестве ацилирующих агентов используют хлорангидриды карбоновых кислот (схема 1).

Схема 1

Некоторые из синтезированных полусинтетических пенициллинов, сохраняя высокую эффективность и низкую токсичность бензилпенициллина, приобрели новые качества, например повышение устойчивости и расширение спектра действия.

В результате разработаны и внедрены в производство такие полусинтетические пенициллины, как метициллин, оксациллиц, ампициллин, карбенициллин, диклоксациллин, карфециллин, амоксициллин и др.

Б) Методы получения полусинтетических цефалоспоринов

Модификация цефалоспоринов по С-3 положению. Отщепление ацетоксигруппы от природного цефалоспорина С впервые было осуществлено гидрогенолизом с использованием значительных количеств палладиевого катализатора. Данные превращения также производятся гидролизом в присутствии ацетилэстеразы или внутримолекулярной циклизацией с участием карбоксигруппы с образованием лактона. При этом образуются производные 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-АДЦК, схема 2).

Схема 2

На сегодня более эффективно превращение 7-АЦК с использованием солей хрома (II) или электрохимическим путем с образованием 3-метиленцефамов. Последние количественно изомеризуются в 7-АДЦК (схема 3). Благодаря нуклеофильному замещению при этом центре были получены сотни модифицированных цефалоспоринов.

Схема 3

Модификация цефалоспоринов по С-7 положению. Поскольку бензилпенициллин обладает большей антибактериальной активностью, чем пенициллин N, были сделаны попытки превратить цефалоспорин С в 7-фенилацетамидоцефалоспорановую кислоту. Вначале это осуществляли мягким кислотным гидролизом с образованием 7-аминоцефалоспорановой кислоты (7-АЦК), однако выходы конечного продукта были незначительными. Поиски фермента, который отщеплял бы боковой остаток аминоадипиновой кислоты в цефалоспорине С, были обширными, но такой ацилазы найти не удалось.

Однако боковая группировка может быть с высоким выходом удалена химическими методами (схема 4). Так, обработка цефалоспорина С нитрозилхлоридом в муравьиной кислоте привела к диазониевой соли, которая самопроизвольно циклизовалась в иминоэфир. После удаления растворителя и избытка летучего реагента боковую группировку отщепляли гидролизом и получали 7-аминоцефалоспорановую кислоту (7-АЦК). После небольших усовершенствований методики выход удалось увеличить до 50%.

Превращение 7-амидогрупп цефалоспорина С в иминохлорид действием пентахлорида фосфора с последующей обработкой спиртом с образованием иминоэфира и дальнейшим гидролитическим расщеплением явилось наиболее простым и эффективным методом. При использовании диметилдихлорсилана для защиты амино- и карбоксильной групп удалось получить 7-аминоцефалоспорановую кислоту с выходом 92,5%.

Доступность 7-АЦК привела к получению множества полусинтетических цефалоспоринов (цефалотина натриевая соль, цефуроксим, цефотаксим, цефокситин и другие), при этом использовались наработки и данные взаимосвязи структура действие, полученные на основе полусинтетических пенициллинов.

Схема 4

Получение цефалоспоринов модификацией пенициллинов. Непосредственным и эффективным способом превращения пенициллинов в цефалоспорины стали реакции с использованием сульфоксидов пенициллина. Поскольку производство пенициллинов путем ферментации обходится значительно дешевле, чем производство цефалоспорина С, этому способу было уделено большое внимание. Кажется вполне вероятным, что в будущем цефалоспорины будут получать путем химических превращений пенициллинов.

Так, превращение тиазолидинового кольца в дигидротиазиновое включает в себя окисление атома серы в пенициллиновом эфире в соответствующий сульфоксид. Это превращение стереоспецифично, проводится окислением натрия периодатом и дает высокие выходы. Сульфоксид метилового эфира пенициллина при кипячении с уксусным ангидридом превращается с выходом 60 % в смесь двух изомеров (соотношение 2:1) – производных пенициллина и цефалоспорина. Производное цефалоспорина при действии триэтиламина, отщепляло уксусную кислоту и превращалось в 7-ациламинодезацетоксицефалоспорин.

Схема 5

Последний также был получен, непосредственно из сульфоксида пенициллина с выходом 10-20% при перегруппировке в ксилоле при 130°С в присутствии следовых количеств 4-толуолсульфокислоты. Выход в этой реакции можно существенно увеличить (до 60%), если ее проводить в 5% растворе уксусного ангидрида в диметилформамиде (схема 5).

Методы анализа антибиотиков. Общих методов идентификации антибиотиков нет, в отличие от других групп препаратов. Так, в основу качественных реакций антибиотиков положена индивидуальность их химической структуры, характер функциональных групп, в зависимости от которых они дают те или иные реакции. На сегодня для идентификации антибиотиков очень широко используются физико-химические методы, основанные на поглощении световой энергии (спектрофотомерия в ультрафиолетовой и инфракрасной части спектра).

Важными показателями качества антибиотиков являются испытания на аномальную токсичность, бактериальные эндотоксины, депрессорные вещества, пирогенность и стерильность, которые устанавливаются биологическим путем.

Методы количественного определения антибиотиков, используемые на сегодня в фармацевтическом анализе, делятся на биологические, физико-химические (хроматографические, спектрометрия в УФ- и ИК-области спектра) и химические (титриметрические).

Важнейшим методом анализа, который используется как для идентификации, так и контроля чистоты и количественного определения антибиотиков, является ВЭЖХ. Обычно используется обращённо-фазовый вариант ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием. Для идентификации антибиотиков также используется ТСХ и спектроскопические методы (ИК- и УФ-спектроскопия), а для количественного определения - УФ-спектроскопия.

Количественное определение некоторых антибиотиков, для которых ВЭЖХ-определение затруднено, проводят микробиологическим методом. Примером таких антибиотиков являются аминогликозиды (канамицин, гентамицин и т.д.). Данные вещества не поглощают электромагнитное излучение ближнего УФ-диапазона и поэтому не могут быть непосредственно (т.е. без дополнительного превращения в другие соединения) определены методом ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием.

Определение биологической активности антибиотиков. Активность антибиотиков определяют путем сравнения степени угнетения роста чувствительных микроорганизмов в результате воздействия испытуемого антибиотика и стандартного образца в известных концентрациях. Количественное определение проводят, используя:

• метод А (метод диффузии);

• метод В (турбидиметрический метод).

Метод диффузии проводят на твёрдых средах. Среды засевают определённым количеством указанных в нормативной документации тест-микроорганизмов. Далее на поверхность среды наносится раствор исследуемого антибиотика и стандартного образца. После инкубирования в течение определённого времени измеряют диаметр зон угнетения роста тест-микроорганизмов, вызванного исследуемым антибиотиком и стандартным образцом.

Определение активности антибиотиков турбидиметрическим методом проводится аналогично, но в жидкой среде, находящейся в пробирке. О степени угнетении роста микроорганизма судят по величине мутности среды.

Многие антибиотики являются смесями веществ, поэтому для ха­рактеристики количественного содержания действующего вещества в образце антибиотика, кроме обычных параметров (масса, массовая доля) используют единицы действия (ЕД). Такой подход был особенно ак­туален в период до начала широкого использования ВЭЖХ для количе­ственного определения антибиотиков.

За ЕД антибиотической активности принимают минимальное количество антибиотика, способное подавлять развитие или задерживать рост стандартного штамма тест-организма (различные штаммы золотистого стафилококка Staphylococcus aureus) в определенном объеме питательной среды. Условные единицы действия выражаются в ЕД/мл или ЕД/мг, то есть количество ЕД содержащихся в 1 мл раствора или в 1 мг препарата. Обычно 1 ЕД соответствует 1 мкг чистого антибиотика (стрептомицин, тетрациклин), хотя бывают и исключения, например, 1 ЕД натриевой соли бензилпенициллина соответствует 0,5958 мкг данного вещества.

Взаимосвязь строение-действие в ряду некоторых антибиотиков

1. Пенициллины (пенамы): биологической активностью обладают только пенициллины, у которых С(5) атом в пенаме имеет R-конфигурацию.

Рассмотрим влияние различных типов модификации пенама на биологическую активность получаемых производных. Окисление серы в положении S(1) пенама с образованием 1S-оксидов и 1S-сульфонов ослабляет антибактериальные свойства соединений. Однако введение второго атома кислорода приводит к получению соединений - необратимых ингибиторов -лактамаз.

Модификация заместителей в С(2) положении пенама с образованием 2- и 2-ацетоксиметильных производных приводит к существенному падению антибактериальной активности. Удаление метильных групп в С(2) положении не оказывает влияния на активность соединений в отношении грамотрицательных, но снижает активность в отношении грамположительных микроорганизмов.

Модификация карбоксильной группы в С(3) положении пенама, приводящая к ее удалению или образованию амидов, нитрилов, изоцианатов, альдегидов, спиртов и других производных, сопровождается резким снижением антибактериальной активности соединений. Все эти С(3) производные практического значения не имеют. Исключение составляют сложные эфиры, которые сами по себе также обладают очень низкой антибактериальной активностью, однако, благодаря наличию сложноэфирной связи, легко могут всасываться в кровь из желудочно-кишечного тракта и гидролизоваться in vivo под действием эстераз с образованием кислот, обладающих высокой активностью. В связи с этим они находят применение в качестве так называемых проантибиотиков, которые легко всасываются при оральном введении.

Модификация в положении С(5) пенама приводит к полной потере антибактериальных свойств соединения, во-первых, из-за увеличения прочности ациламидной связи в -лактамном кольце и, во-вторых, из-за стерических затруднений при взаимодействии антибиотика с ПСБ.

Введение заместителей в С(6) положение пенама имеет ключевое значение с точки зрения создания новых лекарственных препаратов. Проводившаяся в начале 60-х годов интенсивная модификация N-ацильного фрагмента в 6 положении пенама привела к получению более 20 тыс. полусинтетических пенициллинов, из которых 37 получили широкое распространение как медицинские препараты. Полученные таким образом аминопенницилины превосходят природный антибиотик по активности и кислотостойкости, а пенициллины-кислоты (оксациллин, карбенициллин, метициллин и другие) - по устойчивости к -лактамазам, так как являются конкурентными ингибиторами этих ферментов. Замена амидной группы в 6 положении на амидиновую привела к созданию амидинопенициллинов, среди которых обнаружены соединения с выраженной активностью по отношению к грамотрицательным микроорганизмам.

2. Цефалоспорины. В отличие от природных пенициллинов, природный цефалоспорин не обладает биологической активностью. Однако структурная модификация цефалоспорина, в первую очередь его ³-цефемного ядра, радикально улучшает фармакологические свойства соединения. Практически все аналоги цефалоспорина, проявляющие биологическую активность, имеют 6R и 7R конфигурацию соответствующих углеродных атомов.

Рассмотрим влияние различных типов модификации ³-цефема на биологическую активность получаемых производных. Модификация ³-цефема в S(1) положении с образованием - и -сульфоксидов цефалоспорина приводит к снижению биологической активности, причем -изомер активнее -изомера.

Модификация ³-цефема в С(2) положении с образованием алкоксигрупп сопровождается снижением антибактериальных свойств по мере увеличения алкильного заместителя. Структурная модификация заместителя в С(3) положении ³-цефема является одним из основных способов воздействия на антибактериальные свойства антибиотика. Заместитель в С(3) положении оказывает также существенное влияние на фармакокинетические свойства соединения. Эти заместители характеризуются большим структурным многообразием, прежде всего благодаря использованию различных азот- и серусодержащих гетероциклических систем. Создание цефалоспоринов IV поколения связано с введением в С(3) положение иминоцефалоспоринов гетероциклических заместителей с четвертичным аммонийным азотом, что привело к увеличению активности соединений, особенно в отношении грамотрицательных бактерий (например, первые цефалоспорины IV поколения цефепим и цефпиром). Повышение антипсевдомонадной активности за счет улучшения клеточной проницаемости было достигнуто путем введения заместителя (4-карбомоил-1-хинуклидин) в С(3) положение иминоцефалоспоринов (цефклидин).

Введение сложноэфирной защиты карбоксильной группы в С(4) положении ³-цефема, отщепляемой неспецифическими эстеразами сыворотки крови, позволяет получать процефалоспорины. Это, также как и в случае пропенициллинов, существенно улучшает фармакокинетические характеристики препаратов.

Введение заместителей в С(6) положение ³-цефема приводит к полной потере антибактериальных свойств цефалоспоринов.

Положение С(7) ³-цефема является ключевым с точки зрения создания новых лекарственных препаратов. Также как и в случае пенициллинов, структурная модификация N-ацильного фрагмента в 7 положении цефема является наиболее радикальным способом воздействия на антибактериальные свойства антибиотика. Например, введение в С(7) положение ³-цефема заместителя на основе 2-(N-защищенной-2-аминотиазол-4-ил)-2(Z)-(метокси­имино)уксусной кислоты привело к созданию цефаспоринов III поколения (иминоцефалоспоринов) с расширенным спектром антибактериальной активности и проявляющих более высокую по сравнению с цефаспоринов II поколения активность в отношении грамотрицательных бактерий (например, цефотаксин, цефтазидим). Введение метокси- и N-формиламиногруппы в 7-положение цефема придает соединениям устойчивость к бета-лактамазам.

Ядерные аналоги цефалоспоринов. Замена атома серы в положении S(1) цефема на кислород, а также перемещение заместителя в ³-цефеме из положения С(3) в положение С(2) приводят к значительному увеличению антибактериальной активности цефалоспоринов.

3. Пенемы и карбапенемы. Пенемы и карбапенемы представляют собой два близких в структурном отношении типа беталактамных антибиотиков, гетероциклический скелет которых образуют соответственно пенем и карбапенем. Как и в случае пенициллина, антибактериальной активностью обладают производные, имеющие R-конфигурацию С(5) атома.

Рассмотрим влияние некоторых видов модификации пенемов и карбапенемов на биологическую активность производных. Включение кислорода в положение S(1) пенема приводит к получению 1-окса-2-пенемов – нестойких в химическом отношении веществ, являющихся эффективными ингибиторами -лактамаз. Введение метильной группы в С(1)-положение карбапенема приводит к стабилизации антибиотика по отношению к действию дегидропептидаз почек. Варьирование структуры заместителя в С(2) положении пенема оказывает незначительное воздействие на биологические свойства антибиотика. Наибольшую активность проявляют пенемы, содержащие в С(2) положении тиоэтильную или карбамоилоксиметильную группы.

Модификация карбапенема в С(2) положении может приводить к повышению кислотостойкости производных, а также увеличению их устойчивости к действию бета-лактамаз. Введение амидиновой группы в 2-тиоэтиль­ный фрагмент карбапенема повышает активность антибиотика в отношении грамотрицательных бактерий.

С(6) положение в пенеме и карбапенеме. Характерной особенностью обоих этих β-лактамов, отличающей их от пенициллинов, является наличие у них широкого спектра антибактериального действия даже в отсутствии заместителя в С(6) положении. Более того, 6-ациламидные производные пенема и карбапенема химически не стабильны и биологически неактивны. Наилучшими антибактериальными свойствами обладают производные пенема и карбапенема, содержащие 1R-гидроксиэтильную группу в 6-положении антибиотика. Она защищает беталактамное кольцо и обеспечивает стабильность антибиотиков в отношении действия -лактамаз.

4. Монобактамы. Монобактам - наиболее перспективный представитель моноциклических беталактамных антибиотиков природного происхождения. Его гетероциклический скелет – монобактам, или азетидинон-2. Открытие монобактама опровергло бытовавшее мнение о невозможности проявления антибактериальных свойств изолированным -лактамным циклом без «поддержки» конденсированной с ним гетероциклической или карбациклической системы.

Рассмотрим роль заместителей в различных положениях монобактама в биологической активности производных. Положение N(1). Основная роль кислотного заместителя (чаще всего - SO₃H) у амидного азота монобактама сводится к ослаблению ациламидной связи в β-лактамном кольце, чрезвычайно стабильной в неактивном N-незамещенном азетидиноне-2. Замена сульфонильной группы на другие электроноакцепторные заместители не приводит к существенному изменению антибактериальной активности производных. Положение С(3). Модификация N-ацильного фрагмента в 3-положении монобактама (3S-конфигурация), как и в случае пенициллинов и цефалоспоринов, является наиболее эффективным способом воздействия на антибактериальные свойства производных. Наиболее активными оказались монобактамы, N-ацильный фрагмент которых, заимствован у цефалоспоринов третьего и четвертого поколений. Стереоизомерные производные, имеющие 3R-конфигурацию, неактивны. Введение метокси- и N-формиламиногрупп в 3-положение приводит к повышению устойчивости антибиотиков к -лактамазам, также, как и в случае пенициллинов и цефалоспоринов.

Введение метильной или карбамоилоксиметильной групп в С(4) положение монобактама способствует увеличению устойчивости производных к -лактамазам. Однако увеличение размера заместителя параллельно с повышением устойчивости к бета-лактамазам снижает антибактериальную активность антибиотиков.

5. Ингибиторы бета-лактамаз (оксапенемы или клавамы)). Наиболее эффективным неконкурентным ингибитором -лактамаз различной этиологии является клавулановая кислота, получаемая биосинтетически. Будучи малоактивным антибиотиком, она находит широкое применение в клинической практике для борьбы с -лактамазной резистентностью микроорганизмов.

Рассмотрим влияние некоторых структурных изменений в клавулановой кислоте на ингибирующую активность получаемых производных. Положения О(1) и С(2). 1-Тиоаналог клавулановой кислоты и ее производные с гидрированной экзоциклической двойной связью обладают менее выраженными ингибирующими свойствами, чем природное соединение. Положение С(3). Превращение карбоксильной группы в метиловый или бензиловый эфиры не изменяет биологических свойств соединения. Аналогичный эффект наблюдается при декарбоксилировании клавулановой кислоты. Положение С(9). Наиболее эффективным способом улучшения ингибирующего действия клавулановой кислоты является модификация заместителей в С(9) положении клавама (рис. 1). Замена гидроксильной группы на амино-, дибензиламино-, фенил-, N-формиламино- приводит к значительному усилению ингибирующих свойств производных.