Генетична інженерія культивуючих клітин ссавців

1. Введення молекул днк в клітини ссавців.

1.1. Введення вірусних ДНК.

1.2. Введення плазмід і фрагментів ДНК.

2. Стабільність гібридних молекул днк в культивуючих клітинах ссавців.

3. Генетична трансформація клітин ссавців.

3.1. Генетична трансформація мутантних ліній.

3.2. Котрансформація.

3.3. Домінантні ампліфікуючі маркери генетичної трансформації.

3.4. Епісрмні вектори генетичної трансформації.

3.5. Регулююча експресія цільових генів.

З появою генетичної інженерії увагу багатьох вчених захопила система культивуючих клітин (культур клітин, культур тканин) ссавців як можливий об’єкт для введення чужої генетичної інформації і аналізу її експресії. Особливий інтерес до культур клітин ссавців став проявлятись, коли стало відомо, що багато еукаріотичних генів роздроблені (екзон-інтронна організація) і лише в системі клітин вищих еукаріот можна досягнути правильного сплайсингу (вищеплення інтронів) транскрибуючою пре-мРНК.

Крім того, багато білків ссавців і їх вірусів синтезуються першопочатково у вигляді високомолекулярних попередників, які в результаті складного специфічного протеолізу переходять у зрілу форму. Мабуть, такий процесинг можливий тільки в системі певних тканинних культур тварин.

У деяких випадках для прояву специфічної біологічної активності важливе значення має гліколізування еукаріотичних білків. Але воно не може відбуватись в бактеріальних клітинах, а в клітинах дріжджів не завжди відповідає природному типу. Інші способи посттрансляційної модифікації білків більш надійно можуть бути реалізовані також лише в гомологічній системі.

Напрямком, що активно розвивається є розробка клонуючих векторів на основі вірусів ссавців і використання їх для створення живих полівалентних вакцин для потреб ветеринарії і медицини.

Як бачимо, є вагомі аргументи на користь розширеного і поглибленого вивчення можливостей генно-інженерної системи культивуючи клітин ссавців. Уже одержані «впечатляючі» результати, але попереду не менш цікаві відкриття в даній області експериментальної біології і біотехнології.

1. Введення молекул днк в клітини ссавців.

1.1. Введення вірусних днк.

Методологія введення молекул ДНК у клітини ссавців з появою генетичної інженерії «привлекла» увагу багатьох дослідників. До того часу уже було розроблено ряд методів трансформації культивуючи клітин тварин нуклеїновими кислотами різних вірусів.

У багато чисельних ранніх експериментах було показано, що при нанесенні на культивуючи клітини ссавців водних розчинів очищених нуклеїнових кислот вірусів, як правило, інфекційність нуклеїнових кислот не виявляється. Це обумовлено насамперед неефективним проникненням вірусних нуклеїнових кислот в клітини, а також деградацією їх нуклеазами, які знаходяться в середовищі. Для збільшення ефективності трансфекції були розроблені спеціальні методи, які допомагають проникненню нуклеїнової кислоти в клітину і захищають її від дії нуклеаз.

Гіпертонічний сольовий метод. Вперше інфекційність очищеної вірусної ДНК на культурі клітин описали Г. диМ айорка із співавторами у 1959 р. Вони показали, що, якщо на моно шар культури клітин тварин нанести ДНК вірусу поліоми в гіпертонічному сольовому розчині (0,5-1,0 М NaCl), утворюються бляшки візованих клітин. Очевидно, зміна осмотичного тиску середовища приводить до активації процесу поглинання клітинами вірусної ДНК. Далі в ряді робіт було показано, що ефективність трансфекції для ДНК вірусів поліоми і SV40 даним методом була близька і складає (1-3)∙10³ БОЕ на 1 мкг ДНК. Для інших типів вірусів одержана даним методом інфекційність ДНК була помітно нижча, що стимулювало розробку нових методичних підходів.

У даний час гіпертонічний сольовий метод витіснений іншими, більш ефективними методами трансфекції клітин ссавців вірусними нуклеїновими кислотами.

ДЕАЕ-декстрановий метод. У 1968 р. Дж.Мак-Катчен і Дж.Пагано опублікували результати дослідження, в якому показали, що полі катіон диетиламіноетилдекстран (ДЕАЕ-декстран) значно збільшує ефективність трансфекції клітин тварин нуклеїновою кислотою віруса SV40. Очищену ДНК віруса SV40 інкубували спочатку в розчині з ДЕАЕ-декстраном, змінюючи його концентрацію від 100 до 3000 мкг/мл. Потім цю суміш наносили на моно шар клітин, який через певний час відмивали від полі катіону і заливали середовищем. В процесі наступної інкубації на моно шарі появлялись бляшки візованих клітин. Ефективність трансфекції ДНК віруса SV40 таким методом складала (1-10)∙10⁶ БОЕ на 1 мкг ДНК. На ефективність трансфекції впливають молекулярна маса (найкращі результати досягаються при використанні поілкатіону з молекулярною самою 10⁶ Да) і концентрація ДЕАЕ-декстрану.

Механізм дії ДЕАЕ-декстран методу до кінця не встановлений, але відомо, що він зв’язується з нуклеїновими кислотами і частково запобігає їх від деградації нуклеазами. ДЕАЕ-декстран також взаємодіє з клітинною мембраною і, очевидно, за рахунок цього збільшує ефективну концентрацію ДНК на поверхні клітин і стимулює піноцитоз, хоча сам при цьому клітинами не захоплюється.

ДЕАЕ-декстрановий метод у порівнянні з гіпертонічним сольовим методом забезпечує значне збільшення інфекційності ДНК різних вірусів. Він простий і дає високо відтворювані результати. До недоліків методу можна віднести то, що для деяких культур клітин ДЕАЕ-декстран може бути токсичним при використанні його у високій концентрації. Крім того, ефективність трансфекції може суттєво залежати від якості препарату ДЕАЕ-декстрану.

Кальцій-фосфатний метод. Аномально низька інфекційність молекул ДНК аденовірусів і безуспішні «попитки» підвищити її, змінюючи буферні розчини, концентрації ДЕАЕ-декстрану і ДНК, заставили Ф.Грехема і А. Ван дер Еба (1973 р.) шукати модифікації даного методу трансферкції. У 1970 р. М.Мандель і А.Хіга показали, що для трансфекції бактеріальних клітин E.coli необхідно обробити їх розчином хлориду кальцію. Тому Ф.Грехема і А. Ван дер Еб нанесли на моно шар клітин КВ, попередньо оброблених ДЕАЕ-декстраном, ДНК аденовірусу Аd5 в розчині CaCl₂. При цьому ефективність трансфекції вдалося підвищити в 10-100 разів. Далі виявилося, що аналогічні результати одержуються, коли клітини не обробляють ДЕАЕ-декстраном. Оскільки в поживному середовищі були присутні фосфати, при додаванні розчину хлориду кальцію утворювався осад фосфату кальцію. Відділення цього осаду з середовища приводило до втрати інфекційності ДНК. В результаті проведених експериментів стало зрозуміло, що трансфекція відбувається в результаті спів осадження вірусної ДНК і утворюючих мікро кристалів фосфату кальцію на клітинний моношар.

На прикладі ДНК віруса простого Гермеса показано, що зразу після спів осадження із фосфатом кальцію вірусна ДНК стає стійкою до руйнування ультразвуком, але комплекс фосфат кальцію – ДНК залишається чутливим до ДНКази протягом 4 год. При взаємодії цього комплексу з культурою клітин тварин ДНК стає стійкою до ДНКази вже протягом першої години. Подальші дослідження показали, що ДНК утворює з фосфатом кальцію стійких комплекс, який при оптимальних умовах поглинає практично усі реципієнтні клітини. Ефективність поглинання клітинами комплексу фосфат кальцію – ДНК значно залежить від рН, при якому формувався цей комплекс, і концентрації ДНК. Важливо, щоб осад фосфату кальцію одержався дрібнодисперсним. Але навіть в оптимальних умовах проведення трансфекції даним методом лише в 1-5% клітин комплекс досягає ядра. Очевидно, проникнення ДНК із цитоплазми в ядро є критичним етапом, який найсильніше впливає на ефективність трансфекції клітин вірусної ДНК. Електронно-мікроскопічна візуалізація дозволила зробити висновок, що мікро кристали комплексу фосфат кальцію – ДНК проникають в клітини тварин фагоцитозом і цей процес триває декілька годин. Фагоцитоз даного комплексу енергетично і температурно залежний і не спостерігається в клітинах з пониженим вмістом АТР чи в клітинах\\х, інкубованих на холоді.

Кальцій-фосфатний метод переважно більш ефективний, ніж ДЕАЕ-декстрановий, при трансфекції лінійними вірусними ДНК і помітно уступає останньому при використанні кільцевих молекул ДНК, Ймовірно, утворення мікро кристалів фосфату кальцію і спів осадження з ними молекул ДНК супроводжується порушенням структури частини цих макромолекул. Особливо даний ефект спостерігається на лабільних кільцевих молекулах ДНК, які після розриву ланцюгів і переходу в лінійну форму вже не інфекційні. ДЕАЕ-декстрановий метод, як більш м’який, забезпечує значно більшу ефективність проникнення кільцевих молекул ДНК в клітини тварин в непошкодженому вигляді, хоча в цілому доля клітин, що поглинули ДНК при оброблянні ДЕАЕ-декстраном, істотно менша, чим при трансфекції кальцій-фосфатним методом.

Існує ряд модифікацій ДЕАЕ-декстранового і кальцій-фосфатного методів. Наприклад, доведено, що обробка культур клітин диметилсульфоксидом (ДМСО) приводить до підвищення ефективності трансфекції. Припускають, що ДМСО збільшує проникність клітинних мембран, внаслідок чого посилюється поглинання клітинами адсорбованих молекул ДНК.

До недавнього часу при введенні молекул ДНК в клітини ссавців найчастіше використовували кальцій-фосфатний та ДЕАЕ-декстрановий методи, так як вони достатньо прості і забезпечують високо відтворювані результати. Але активно ведуться пошуки інших, більш простих і ефективних методів трансфекції вірусними ДНК.

Мікроін’єкція вірусних молекул ДНК. А.Грессман (1970 р.) для введення молекул ДНК в культивуючи клітини ссавців запропонував використовувати метод мікроін’єкції. Процедура полягає у введенні в клітину (цитоплазму чи ядро) малих об’ємів рідини (біля 10^-8 мкл) за допомогою скляного мікро капіляра (рис.3.1.). Експеримент проводиться на предметному столику мікроскопу із застосуванням мікроманіпуляторів, і мікро шприців. Використовуючи цю методику, вдалося вивчити біологічну активність молекул ДНК різних вірусів. До переваг методу відноситься то, що певну кількість препарату ДНК можна ввести у вибрану область клітини, частково в ядро. Недоліком методу є складність і невисока продуктивність. Крім того, очевидно, він застосовується лише до невеликих молекул ДНК, так як при продавлюванні через мікро капіляр цілісність великих молекул ДНК буде порушуватись внаслідок гідродинамічного зсуву. Дивлячись на вищеперчислені недоліки, метод мікроін’єкції при аналізі інфекційності вірусних ДНК використовується вкрай рідко.

Ліпосомний метод. Синтетичні фосфоліпідні везикули – ліпосоми – першопочатково використовувались для введення в клітини ссавців різних лікарських речовин. Після 1980 р. ліпосоми почали застосовувати і для введення в культивуючи клітини тварин вірусних нуклеїнових кислот. На нуклеїнові кислоти, заключні в ліпосоми, не діють нуклеази і вони легко проникають в клітини за рахунок злиття ліпосом з клітинною мембраною чи поглинання їх шляхом фагоцитозу. У ряді випадків, застосовуючи ліпосоми, вдається досягнути більш високого рівня трансфекції вірусними ДНК, ніж за допомогою кальцій-фосфатного чи ДЕАЕ-декстранового методів.

Даний метод не дуже простий у виконанні і потребує підбору умов трансфекції для кожної конкретної культури клітин. На ефективність трансфекції ДНК впливають такі параметри, як морфологія ліпосом, склад і відношення в них різних ліпідів, умови інкубації ліпосом з клітинами (змінюючи ці умови, можна одержати результати, які відрізняються на три порядки). Ефективність заключення ДНК в ліпосоми істотно залежить від розміру її молекули. Чим більша вірусна ДНК, тим з меншою ймовірністю вона інкапсулюється у фосфоліпідні везикули. Це пов’язано не тільки із стеричними затрудненнями, оскільки із способом упакування ДНК в ліпосоми. Переважно використовують процедуру озвучування, яка приводить до розривів молекул ДНК, частота яких пропорційна величині молекули. Через відмічені труднощі даний підхід до трансфекції клітин вірусної ДНК не знайшов широкого розповсюдження.

Використання катіонних ліпідних реагентів. В останні роки розроблені катіонні ліпідні реагенти (ліпофектин, ліпофектамін, селфектин та ін.), які забезпечують просте, швидке і відтворюване введення молекул нуклеїнових кислот в культивуючи клітини ссавців і комах. Розчин ДНК просто змішують з фірмовим катіонним ліпідним реагентом і наносять на моношар культури клітин (рис.13.2). При цьому ефективність введення ДНК в еукаріотичні клітини переважно перевищує таку при використанні ДЕАЕ-декстранового чи кальцій-фосфатного методів.