3.1. Нокаутні миші.

Складність геному ссавців, їх ембріонального розвитку, тривалий період до самого розмноження, і складності вивчення великої кількості індивідуальних тварин роблять генетичний аналіз цих систем складним. Спрямована інактивація генів є надзвичайно важливим методичним прийомом, який використовується для одержання трансгенних тварин. Найбільший розвиток такі роботи одержали в експериментах на мишах. Створення ліній мишей, гомозиготних по спрямовано ін активованому гену, дозволяє вивчати детерміновані даним геном властивості на рівні організму. Завляки появі методології одержання нокаут них мишей молекулярна генетика цієї зручної лабораторної моделі стала розвиватись швидкими темпами.

Схема одержання нокаут них мишей виглядає наступним чином. Фрагмент цільового гену, який планують ін активувати in vivo, виділяють з геномної бібліотеки миші на основі фагу λ, космід і т.д. Всередину цього фрагменту вбудовують домінантний селективний маркер, одночасно частина цільового гену делетується. У результаті одержують гібридну плазміну, в якій до селективного маркера справа і зліва приєднані сегменти цільового Мишиного гену (фланкуючі послідовності). Таку конструкцію часто називають націленим вектором (targeting vector). Для підвищення ефективності гомологічної рекомбінації фланкуючих послідовностей з хромосомним геном націлений вектор переважно розщеплюють якою-небудь рестиктазою поза фрагментом вбудови для переводу його з кільцевої у лінійну форму. Одержану лінійну ДНК вводять (найчастіше електропорацією) в культуру ембріональних стовбурових клітин миші (див. рис.) і на селективному середовищі відбирають клони трансформантів. За допомогою ПЛР і блотингу по Саузерну виявляються трансформанти, що утворились в результаті гомологічної рекомбінації, що привела до інерційно-делеційної інактивації цільового гену. Відібрані клони гетерозиготні по мутантному гену, так як інактивуюча вставка є в одній із гомологічних хромосом. ES-клітини із спрямованою мутацією ін’єкують в бластоцисти, які потім поміщають в яйцевід псевдовагітних самок. Химерних мишей, що народжуються, схрещують із мишами вихідної лінії і одержують гетерозиготних нащадків по цільовому мутантному гену. Цих гетерозигот схрещують між собою і відбирають в нащадках гомозиготних по мутантному гену мишей. На кожному етапі генотип мутантних мишей визначають за допомогою ПЛР і блотингу по Саузерну, використовуючи зразки геномної ДНК, яку виділяють із біоптатів хвоста тварин.

За описаною схемою Х.Такада із співавторами (2003 р.) здійснили спрямовану інактивацію гену SODD у мишей (рис.2).

Крім молекулярно-генетичного аналізу нокаутні миші можуть бути корисні при створенні ліній, більш чутливих до того чи іншого інфекційного агента людини чи тварини, чим вихідні тварини. Для розробки нових методів терапії і оцінки ефективності кандидатних вакцин важливо мати зручну лабораторну модель, що часто є великою проблемою. Одним з прикладів реалізації такого підходу є робота П.Хофмана із співавторами (2003 р.), в якій були одержані нокаутні миші, дефектні по гену інтерлейкіну 12. Такі миші були зручною високочутливою моделлю колонізації слизової шлунка бактеріями Helicobacter pylori, які спонукають розвиток язви шлунка у людини. Геном даної бактерії повністю секвенований. Тому створена лабораторна модель дозволить вивчити молекулярні фактори патогенності цієї бактерії і розробити нові методи терапії захворювань, викликаних цією бактерією.

Слід зауважити, що можливість спрямованої інактивації генів мишей в результаті гемолітичної рекомбінації революціонізувало вивчення генетичного контролю розвитку і фізіології ссавців. Але використання технології одержання нокаутних мишей не завжди дає позитивний результат. Це обумовлено тим, що інактивація ряду генів приводить до летального ефекту. Крім того, селективний маркер, який вводять, може впливати на фенотипічний прояв мутації. Дані обмеження можна «преодолеть» створюючи систему регульовано включення-виключення цільового гену в процесі індивідуального розвитку тварини у всьому організмі чи в певних органах.

3.2. Регульоване включення-виключення генів in vivo.

Перший метод контрольованої модуляції експресії трансгена in vivo був розроблений М.Лаксо із співавторами в 1992 р. Ними остроумно були використані властивості рекомбінази Cre бактеріофагу Р1, яка без додаткових факторів каталізує реципрокну рекомбінацію між специфічними локусами кросинговера loxP цього фага. Послідовність loxP складається з двох інвертованих повторів довжиною 13 пн, розділених спейсерним районом з 8 пн. Якщо між двома ділянками loxP, розташованими в прямій орієнтації, є ділянка ДНК, то в присутності Cre відбувається ви щеплення цієї ділянки і у вихідній ДНК залишається одна копія локусу loxP.

Для вивчення можливості системи cre/lox активувати мовчазний трансген в миші автори створили три гібридні конструкції. У перших двох кодуючи послідовність гена cre вбудували під контроль промотора або гена mαA мишиного αА-кристаліну (експресується тканиноспецифічно в хрусталику ока), або раннього гену цитомегаловіруса людини (hCMV) (рис.4). У третій плазміді послідовність Tag, що кодує великий Т-антиген віруса SV40, вбудували під контроль промотора гена mαA, але між цими двома елементами помістили так звану Stop-послідовність, обмежену з обидвох сторін ділянками loxP. Stop-послідовність містила сегмент розміром 550 пн з 3’-кінцевою частиною гена HIS3 дріжджів, що підсилює ефективність термінацїі транскрипції, яка ініціюється з промотора р_mαA, на ділянці полі(А) віруса SV40. Щоб надійніше «предотвратить» продукцію ТАg, був вбудований також синтетичний фрагмент ДНК, що імстить ініціатор ний триплет ATG і 5’-кінцевий донорний сайт сплайсингу 5’SD (див.рис.4).

…….

Розглянуті системи регульованої експресії транс генів застосовуються у багатьох лабораторіях. Такий підхід дозволяє досліджувати тонкі механізми дії продуктів того чи іншого гену на фізіологію і ембріональний розвиток ссавців.