1.3. Ембріональні стовбурові клітини.

При створенні трансгенних тварин використовують також плюрипотентні стовбурові клітини (ES-клітини), взяті з бластоцисти. ES-клітини можна культивувати in vitro і після необхідних маніпуляцій вернути в організм ін’єкцією в бластоцисту. Клітини колонізують ембріон і приймають участь в його нормальному розвитку, даючи початок клітинам усіх типів соматичних тканин і нерідко клітинам зародкового шляху. Перед ін’єкцією ES-клітин в бластоцисту в них вводять цільові трансгени – або шляхом трансфекції, або інфікуючи їх рекомбінантними ретровірусами. Практична перевага цієї методичної схеми в тому, що вона дає можливість проводити селекцію трансформованих ES-клітин за певним параметром. Це може бути кількість копій трансгену, його хромосомна локалізація чи характер експресії. Усі одержані за такою схемою первинні трансгенні тварини – мозаїчні організми, які складаються з клітин, які містять трансген, і які не містять трансген; тому для одержання чистих трансгенних ліній необхідна селекційна робота. Крім того часто ES-клітини не здатні колонізувати зародкові тканини, що пояснюється накопиченням хромосомних порушень в процесі культивування і селекції in vitro.

Проблему мозаїчності первинних трансгенних тварин можна «преодолеть», якщо використовувати в якості донорів ядер трансформовані ES-клітини, які пройшли селекцію (див. рис.). Ядра ES-клітин, що несуть трансгени, здатні колонізувати енуклейовані ооцити, які потім продовжують свій нормальний розвиток. В результаті можна одержати тварину, в кожній клітині якої буде міститись трансген.

1.4. Ретровіруси.

Інфікування передімплантованих ембріонів рекомбінантними ретровірусами – відносно нескладна процедура, яка не потребує дорогого обладнання. Ембріони інфікують наступним чином: восьми клітинну морулу (рис.) звільняють від яйцевої оболонки і поміщають в культуральну чашку з фібробластами, які продукують рекомбінантнийр етровірус. Після інфікування ембріони, що досягли стадії бластоцисти, вводять в матку псевдо вагітної самки; частина ембріонів продовжує нормально розвиватись і в необхідний час перетворюється в трансгенних дітей.

У результаті використання даної схеми часто формується організм, мозаїчний за кількістю і локалізацією вірусних вбудувань в клітинах. Тому для одержання чистих ліній, необхідних для дослідження експресії введених генів, потрібно масштабний аутбридинг.

2. Експресія генів в трансгенних мишах.

3. Трансгенні тварини у фундаментальних дослідженнях.

Трансгенна технологія має великі можливості, в першу чергу для фундаментальних наукових досліджень. Експерименти з трансгенними мишами дозволяють забезпечити прогрес в молекулярній біології та генетиці ссавців. Цьому, частково, «способствует» розвиток таких напрямків наукового пошуку:

- аналіз цис-діючих контролюючих елементів, які відповідають за тканинну специфічність – тимчасову і фізіологічну регуляцію експресії генів;

- аналіз фізіологічних наслідків (на рівні цілого організму) різних відхилень в експресії генів, в тому числі онкогенів;

- одержання випадкових нових мутантів, які виникають в популяції трансгенних мишей в результаті входження трансгену в послідовність того чи іншого функціонального гену (мутований ген можна виділити, використовуючи трансген в якості гібридизаційної проби);

- одержання мутантів із спрямовано інактивованими генами – так званими нокаутними (від англ. knock out – вибити) тварин.