1.2. Мікроін’єкція ооцитів.

У 1982 р. показано, що чужі еукаріотичні гени, введені мікроін’єкцією в ооцити Xenopus laevis чи культивовані клітини тварин, здатні експресуватись в гетерологічному «окружении». При цьому чужа ДНК може інтегруватись в геном клітини. Одержані результати вказували на то, що мікроін’єкція молекул ДНК в запліднені ооцити тварин може бути перспективним методом введення чужих генів в організм тварин.

Метод мікроін’єкції ДНК в ооцити в даний час найпопулярніший у дослідників, зайнятих одержанням трансгенних тварин, не дивлячись на то, що він потребує високої кваліфікації і дорогого обладнання. Це не дивно – швидкість і надійність даного методу окуповують усі його недоліки. Першою і найбільш добре розробленою експериментальною системою для одержання трансгенних тварин є миша.

Процес одержання трансгенних мишей за допомогою мікроін’єкції схематично показано на рис. Донорних мишей-самок з експериментальною суперовуляцією схрещують із самцями, через 12 год. після спарювання «вскривают» яйце води, виділяють запліднені яйцеклітини і поміщають їх в культуру. Дальше в більший з двох пронуклеусів (переважно чоловічий) ін’єкують очищену клоновану ДНК. Ооцити, які пережили ін’єкцію, повертають у природнє середовище, пересаджуючи їх в яйцевід псевдовагітної (12 год. після коїтусу) реципієнтної самки. Псевдо вагітнихсамок одержують, спарюючи статевозрілих самок із стерилізованими самцями.

Частина трансплантованих ооцитів продовжує розвиватися певний час, і потім народжуються дітки – природнім чином або за допомогою операції. Трансгенних тварин в приплоді ідентифікують, використовуючи специфічну ПЛР і гібридизаційний аналіз високомолекулярною геномною ДНК, виділеною із тканин хвоста.

Після цього як первинні трансгенні тварини ідентифіковані, проводять їх схрещування для одержання трансгенних ліній. Зрозуміло, що такі лінії повинні бути одержанні перш ніж тварини-основа буде «омертвлена» для детального дослідження. Найкраще, якщо тварина-основа – самець, оскільки її можна швидко схрестити з декількома самками, тоді як самка-основа лінії повинна виносити і вигодувати хоча в одне потомство, перш ніж її можна буде вбити. Бажано провести гібридизаційний аналіз і ідентифікувати трансгенних тварин першого покоління ще при житті батьків.

У більшості випадків 50% нащадків, одержаних від схрещування тварин-основ з тваринами дикого типу, є трансгенними, але і батько-основа, і потомки першого покоління гетерозиготні по трансгену. Необхідно відмітити, що деякі трансгенні тварини-основи є мозаїчними і, відповідно, трансгенними буде менша частина нащадків першого покоління. Усіх дітей слід аналізувати, поки не буде виведена гомозиготна лінія. У ряді випадків гомозиготні лінії одержати не вдається, оскільки від 5 до 15% трансгенних інерцій в гомозиготному стані летальні.

Ефективність процедури одержання трансгенних мишей шляхом мікроін’єкцій сильно змінюється від експерименту до експерименту. В оптимальних умовах ін’єкцію переживає 60-80% яйцеклітин, з них 10-30% імплантуючись в організм реципієнтної самки, продовжує нормально розвиватись і дає нащадків. 10-30% новонароджених мишей є трансгенними.