3.3 Изучение реологических свойств

Нами было исследовано усвоение воды, семенами маша. Усвоение воды начинается физико - химическим процессом диффузии ее внутрь эндоспермы маша, когда вода проникает через оболочку и диффундирует дальше по объему эндоспермы. Как известно диффузионный поток Ф определяется вектором градиента концентрации воды, как диффундирующего агента:

Ф≈K_g grad [Н₂О]ⁿ (3.2)

где

K_g-константа диффузии молекул воды, то есть диффузионный поток обусловленный градиентом концентрации воды

grad[Н₂О]= [Н₂О]+ [ [Н₂О]+ [ [Н₂О] (3.3)

Нами разработан способ определения потока Ф, который имеет ярко выраженное направление, ориентированное в сторону ростка. Для определения вектора Ф нами использовалась люминесцирующая метка, в качестве которой выступает соль натрий- флуоресциина ( 1-2 мг/л) растворимого в слабо щелочном растворе. В этот раствор помещались исследуемые семена, в которых люминесцирующая соль, как оказалось, локализовалось в эндосперме вокруг ростка. Необходимо отметить, что сама соль уже на первичной стадии диффузии через оболочку эндоспермы претерпевала некоторые химические изменения, выражающиеся в переходе соли в не люминесцирующую форму, что связано с поглощением оболочкой ОН^- из люминесцирующего комплекса.

При контакте с раствором щелочной среды люминесцирующей соли оболочка эндоспермы существенно меняла окраску. Приложение В

Из этого факта следует заключить, что диффузия воды также осложняется химической активностью выражающейся в действии молекул оболочки на молекулы НОН. Однако сила вызывающая направленное движение воды к ростку превосходит рассеивающую этот поток химическую энергию.

В результате исследования влагоудерживающей способности, выяснилось, что масса семян маша при взаимодействии с водой увеличивается, это свидетельствует о том что семена поглощали воду. Скорость поглощения воды неодинакова в процессе прорастания w≈f(t). Это объясняется постепенным заполнением водой пустот внутри семян, которые имеют разный объем и разную проницаемость. Поэтому вода поглощается по разным механизмам. Часть воды занимает крупные поры в эндосперме. Остальная часть воды занимает более мелкомасштабные дефекты. Очевидно, что в первую очередь заполняются крупные пустоты- поры эндоспермы, а затем более мелкие. Чем выше объем пустот, тем менее вероятно в пределах их объема явление химически связанной воды. В мелких порах сфера удерживает воду с силой прямо пропорционально поверхности, к которой прилегают молекулы воды. Следовательно, в дефектах структуры– пустотах эндосперма, линейный радиус, которых соответствует значения r_i,близко к линейным размерам молекулы воды, последние имеют прочность связи со стенками, соответствующую химической связи. Химическая связь более прочная, ее появления, тем более вероятно, чем ближе молекула воды подойдет к молекулам структур эндоспермы. Взаимодействие молекул по вандервальскому механизму образует связь прочность, которой примерно 40 ккал/моль (Е≤10 ^-19 Дж/молекул). Вандервальский механизм может реализовываться, кода молекула воды от молекулы субстрата находятся на расстоянии r≥10 ^-8 м. Поэтому можно сказать, что распределение поглощаемой воды в конкретных семенах по прочности их удерживания являются важной характеристикой биологической активности прорастаемых семян. Эту характеристику можно получить, изучая как механизм поглощение воды, так и механизм испарения воды, «высушивания» семян, то есть ее удаление из эндоспермы. При высушивании вода постепенно испаряется и в первую очередь покидают эндосперму и семя в целом, то есть воду, которая слабо связана. Для того что бы дифференцировать указанную воду по энергии связи ее молекул, ее необходимо испарять ее при разных температурах.

Таким образом, получаются кривые зависимости ∆m полученных при разных режимах сушки от времени выдерживания семян в воде. Из зависимости следует, что в пределах инкубационного периода расходования воды внутри растения наблюдаются изломы, так называемые фазовые переходы в воде, определяемые биохимией усвоения воды семенами. Отсюда определяется кинетика заполнения уровней воды как среды обитания семян. Чем больше воды заполняющей мелкомасштабные дефекты, то есть воды, которая химически связывается с веществами эндоспермы, тем больше воды участвует в биохимических реакциях.

На Рис. 2 А),Б) представлена зависимость роста m% от времени контакта семян с водой в течении 2 часов, интервал между измерениями от 10 мин до 2 часа. Найдено, что данная зависимость нелинейна. Скорость накопления воды в эндосперме неодинакова. И действительно, в полулогарифмических координатах (log m% - ∆t) эта нелинейность становится очевидной. Еще в большей степени отсутствие линейности от времени накопления воды семенами отражается при наблюдении за ними в течение 3 часов Рис 6.А),Б)

А)

Б)

Рисунок 5. А) График зависимости изменения массы семян маша от времени выдерживания (в течение 2 ч.), Б) График зависимости изменения логарифма массы семян маша от времени выдерживании (в течение 2 ч.)

А)

Б)

Рисунок 6. А) График зависимости массы семян маша от времени выдерживания (в течение 3 ч.), Б) График зависимости логарифма массы семян маша от времени их выдерживания (в течение 3 ч.).

Предполагается, что скорость поглощения воды эндоспермом определяется формулой:

w= К[Ц_погл.]^а [Н₂О]^в т,е (3.4)

m%=K∆t (2)

где

К- коэффициент пропорциональности;

∆t - время контакта семян с водой

Оцениваемая величина К определяет скорость накопления воды в эндосперме и можно считать ее постоянной величиной в интервале значений ∆t меньше 30 мин., в этом случае можно записать:

К=w= const (3.5)

Скорость не остается постоянной, когда контакт прорастаемых семян с водой становится более длительным. На основании значений К, нами был установлен разный механизм удерживания воды семенами маша. Это достигается различной температурой высушивания. Высушивание- испарение воды из эндоспермы. Процесс зависит от степени удерживания воды структурой эндоспермы, то есть центрами поглощения воды и ее удерживания. Этот процесс поглощения воды выражается схемой:

1)Цп_.+ Н₂О→(Цп)_а(Н₂О)_в (3.6)

Тогда обратный ему процесс:

2) (Цп)_а*(Н₂О)_в→Цп_а(Н₂О)_(в-с)+ с_*Н₂О (3.7)

где:

Цп- центры поглощения;

а– число центров;

в - количество молекул воды, связываемое с центрами;

с- количество молекул воды покинувшее центры.

Поскольку энергия связи воды, как указывалось разная, то число с определяется температурой испарения, то есть высушивания. Процесс сушки - его скорость определяет энергию связи в том случае, когда изучается зависимость скорости испарения от температуры испарения. Зависимость скорости испарения от температуры зависит по уравнению Аррениуса:

К = К_о (3.8)

где

К_о – константа скорости при Т= 0;

Е- энергия активации;

R- универсальная газовая постоянная

Преобразуем уравнение (3.8) в форму удобную для использования в нашем случае:

= -Е/RT или = E_*X, (3.9)

где

w = ; или w= ,

Х= -

Рис.7 А) соответствует высушиванию семян, которые мы назвали «сухими», имея, введу, что они не контактировали с водой в наших опытах. График соответствует координатам: lnw- Рис. 4 Б)

А)

Б)

Рисунок 7. А) График зависимости скорости испарения воды w от 1/T, Б) График зависимости логарифма скорости испарения воды w от 1/T

Видно, что зависимость нелинейная и имеет несколько участков с разным углом наклона по отношению к оси абсцисс, то есть к оси 1/T. Этот угол наклона соответствует энергии активации. Рис.6 Б) И из этого следует, что вода в центрах находится в разных формах. Более показательно в этом отношении график зависимости lnw от 1/T для семян маша подвергающимся контакту с водой (набуханию) в течение некоторого времени Рис.7.

В этих случаях вода, взаимодействуя с центрами поглощения (набухания) закрепляется там на столько, что при повышении температуры она образует более прочные соединения, которые разрушаются при повышении температуры более 50 С ͦ. И в интервале от 30 С ͦ до 50 С ͦ прочти во всех случаях набухания скорость испарения воды падает по отношению к более низким температурам. Тогда можно сказать, что вода участвует в двух конкурирующих процессах вызванных повышением температуры, при которой происходят испареня молекул воды из эндоспермы (реакция происходящая в соответствии схемы (16) и процесс обратный, упрочнения воды внутри эндоспермы:

Н₂О+ Цп_.→(Цп)_а1(Н₂О)_в1 (3.10)

Природа соединения соответствует продукту химического взаимодействия центров с молекулами воды. Осуществление реакции (8) есть преддверие биологической активации ее в эндосперме. И поскольку исходя из наших опытов реакция (19) происходит в области температур 30 С ͦ и 40 С ͦ , то можно сделать вывод об оптимальной температуре прорастания , когда биологически активной воды становится максимально, о чем говорит подъем скорости испарения на Рис.7

Рисунок 7. График зависимости скорости испарения воды w от 1/T

Из этого следует, что оптимальной температурой проращивания будет является температура около 30- 35 С ͦ.

Помимо воды для пробуждения ростка и его питания требуется питательные вещества: белки, липиды, но в первую очередь углеводы. Расход этих веществ нами контролируется ниже изложенными методами. Для определения расходования углеводов в эндосперме было взято на вооружение расход крахмала в процессе прорастания. При идентификации крахмала и определения его количества использовался усовершенствованный нами традиционный метод йодометрии. Как оказалось, процесс прорастания сопровождается уменьшением количества крахмала, который расходуется на образование низкомолекулярных форм углеводов, в том числе моносахаридов, например, глюкозы и т.д. Для контроля за содержанием крахмала семена маша, подвергаются измельчению в муку. 1 гр. муки пророщенных семян маша и чистого картофельного крахмала заливаются 100 мл. воды и добавлялся раствор йода J₂ ≈0,02%. Под действием йода взвесь муки при наличии крахмала окрашивается в соответствующие цвета в зависимости от степени гидролиза крахмала. Оценка содержание крахмала осуществляется при наблюдение седиментации окрашенных частиц муки при измерении зависимости оптической плотности D от времени t. Оптическая плотность D пропорционально количеству частиц n дисперсной фазы участвующих в седиментации D=f(n). D соответствует потоку Ф= осаждаемых частиц: D=f₁(Ф).То есть f₁ cсоответствует кинетики седиментации, следовательно Ф= . Рис 8.

Рисунок 8. Кинетика осаждения исследуемой муки в зависимости от времени.

Кинетику седиментации наблюдается с помощью фотоэлектроколориметрирования. Было выявлено, что оптимальное условия определения оптической плотности - D соответствует длине волны λ =590 н.м. Определение количества крахмала осуществляется из анализа кривых зависимости, то есть D=f(t). Количество крахмала в 1 гр. муки семян маша сравнивался с таким же количеством муки чистого крахмала. При сохранении одних и тех же условий седиментации, имелась возможность использовать формулу:

m= (3.11)

или m~S

где

S- площадь, ограниченная кривой и осями координат на графике D=f(t), тогда

m_крах%.=m_чист (3.12)

где

S₁, S₂- указанные площади для седиментации исследуемой муки и чистого крахмала соответственно. Указанная площадь сравнивалась с помощью той же самой зависимости для чистой крахмальной муки. Для сохранения условий воспроизводимости используется крахмал и исследуемую муку при одной и той же степени дисперсности и количестве.

На Рис.8 показаны кривые, отражающие кинетику седиментации крахмала и исследуемой муки. Определяется процентное содержание крахмала в муке из не пророщенных семян и пророщенных семян маша сравнивается с процентным содержанием чистого картофельного крахмала.

Аналогичный контроль за изменением белковой фракции в составе эндоспермы семян маша осуществлялся, также спектрофотометрическим методом. Идентификация белка осуществляется при определении соотношения n интенсивностей полос в спектре поглощения (Рис.8). В процессе прорастания семена маша подвергались измельчению в условиях получения одинаковой степени дисперсности. Наблюдается седиментация D=f(t) при значении оптической плотности при 260 и 280 н.м. При этом используется регистрирующий спектрофотометр, позволяющий сканировать D при разных длинах волн в ультрафиолетовой области. В этом случае рассчитывается отношения значений D при указанных длинах волн, то есть величина n, которая соответствует наличию данных видов белков. Концентрация данного вида белков регистрируется по самим значением n (3.13)

Такой метод основан на эмпирической закономерности найденной Калькара [80].

Липидные фракции эндоспермы семян маша контролировались по их эмульсирующий способности, которая отражается в поверхностно -активных свойствах сред. Как оказалось смесь муки маши обладает таковыми свойствами. Особенно это прослеживается, когда мука готовится из проросших семян маша методом капиллярного определения поверхностного натяжения σ. Выявлено, что поверхностное натяжение, а, следовательно, эмульгирующаяся способность существенно меняется в сторону уменьшения при углублении процесса проращивания. Например, если проращивание семян осуществляемых в течение суток, то изменение σ водных экстрактов пророщенных семян, по отношению к водным экстрактам полученных из не пророщенных семян соответствует величине ∆ σ ≥10%.

Интегральный контроль над процессом проращивания, как процессом накопления биологически активных соединений, осуществляется также в нашей работе электрохимическими методами, и в частности методом основанной на измерении электрохимического отклика I - анализируемой системы экстрактов муки пророщенных семян.

При изменении подвижности ионов, ионорадикалов, сальватированных структур экстрактов сказывается на значении I, то есть чем выше подвижность, тем I выше:

I=f(орган. cоед.)^+- (3.14)

Эффективность значения концентрации (органических соединений)^+- определяется γ^+- и С (орган. соед)

γ^+- - коэффициент подвижности токообразующих частиц.

С- концентрация характеризуемых соединений.

При постоянном значении С показатель I, тем выше, чем больше значение γ.

I =f(γ^+-) (3.15)

Нами выявлено, что экстракт из непророщенных семян и пророщенных семян маша, то есть по сути смесь муки и воды сильно отличаются друг от друга Рис.9

Рисунок 9. Кривая зависимости I от времени Т.

На основании этого результата был сделан вывод, что в муке из пророщенных семян маша электрохимический отклик гораздо быстрее меняется со временем в сторону уменьшения. Это объясняется реакционной способностью токообразующих структур в муке частиц из пророщенных и не пророщенных семян маша.