Дифференциальная диагностика

Хламидиоз животных следует дифференцировать от: бруцеллеза, лептоспироза, болезни Ауески, листериоза, сальмонеллеза, пастереллёза, микотоксикозов, стрептококкоза, стафилакоккоза. У свиней дополнительно дифференцируют от: гемофилёзного полисерозита и актинобациллярной плевропневмонии, болезни Тешена, энтеровирусного гастроэнтерита, цирковирусной инфекции, респираторно-репродуктивного синдрома, классической чумы, парвовирусной инфекции.

Приложение 1

Окраска по методу Романовского — Гимза.

Маточ­ный раствор краски Романовского — Гимза разбавляют фосфатно-буферным раствором (рН 7,2), для получения которого готовят: раствор А — 9,5 г двузамещенного Na₂ HРО₄ растворяют в 1 л дистиллированной воды; раствор Б — 9,2 г однозамещенного NaН₂РО₄ растворяют в 1 л дистиллированной воды.

Для приготовления буферного раствора с рН 7,2 сме­шивают 72 мл раствора А с 28 мл раствора Б и добав­ляют 900 мл дистиллированной воды. На каждый милли­литр буферного раствора вносят 2—4 капли маточного раствора краски. Фиксированные мазки окрашивают в специальных кюветах вертикально при комнатной темпе­ратуре в течение 20—24 ч, промывают дистиллирован­ной водой и дифференцируют около 10 с подкисленным эталоном (3—5 капель ледяной уксусной кислоты на 15—20 мл спирта), вновь промывают, высушивают и ис­следуют в световом микроскопе.

Элементарные тельца хламидий красно-фиолетовые, промежуточные формы - сине-фиолетового цвета.

Для выявления хламидий, расположенных внутри клеток, используют модифицированный метод Романов­ского — Гимза. Фиксированные препараты-мазки покрывают ма­точным раствором красителя на 10 мин. Краску не сли­вают, добавляют 3—5 капель дистиллированной воды (рН 7,0) и окрашивают при комнатной температуре 16— 18 ч. После промывки дистиллированной водой диффе­ренцируют этанолом 45—60 с, вновь промывают дистил­лированной водой и повторно дифференцируют этано­лом 30 с. Промывают дистиллированной водой, высуши­вают на воздухе.

Элементарные тельца хламидий, расположенные в цитоплазме клеток, красно-фиолетового цвета, тельца-включения — сине-фиолетовые.

Окраска по модифицированному методу Гименеж (Набли Б., Таризо М., 1967). Мазки готовят из стенок желточных мешков куриных эмбрионов, в которых куль­тивировали хламидий, затем фиксируют над пламенем. Препараты окрашивают 0,25%-ным водным раствором основного фуксина в течение 5 мин, промывают водой, окрашивают 0,8%-ным водным раствором малахитового зеленого 30 с и промывают водой. Затем обесцвечивают 0,5%-ным раствором лимонной кислоты в течение 2 мин, промывают и повторно окрашивают малахитовым зеле­ным 30 с. Обесцвечивают 1%-ным раствором хлоралгидрата в течение 1 мин, промывают водой, высушивают. Элементарные тельца и тельца-включения хлами­дий - красного цвета, фон зеленый.

Окраска по модифицированному методу Стемпа. Пре­параты фиксируют над пламенем и окрашивают карбо­ловым фуксином Циля, разведенным дистиллированной водой 1:5 (рH – 7,4) в течение 15 минут. Маточный раствор готовят по прописи: 1 г основного фуксина растворяют в 10 мл этилового спирта, 5 г карболовой кислоты (фенола)— в 100 мл дистиллированной воды. Оба раство­ра смешивают, фильтруют через 4—5 слоев фильтровальной бумаги. Хранится продолжительное время. Пе­ред употреблением нужное количество разводят 1:5.

Препараты промывают дистиллированной водой, диф­ференцируют 0,5%-ным раствором уксусной кислоты или 0,05%-ным раствором серной кислоты в течение 1 мин (модификация Гаффарова X. 3.), промывают водой, окрашивают 1%-ным раствором малахитовой зелени 30 с, снова промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой.

Элементарные тельца хламидий красные на сине-зе­леном фоне. Инициальные тельца в одних случаях окра­шиваются в красный, в других - в зеленоватый цвет. Метод рекомендуется для исследования патологическом материала, в частности плаценты.

Окраска по Маккиавелло. Готовят три раствора: раствор А - 250 мг фуксина основного растворяют в 100 мл бидистиллированной воды (хранится 10 дней при температуре 4°С); раствор В - 10 г лимонной кислоты растворяют в 100 мл бидистиллированной воды; рас­твор С - 1 г метиленовой сини растворяют в 100 мл би­дистиллированной воды.

Техника окраски: мазки фиксируют над пламенем; раствор А фильтруют через фильтровальную бумагу и наносят на мазок, покрытый фильтровальной бумагой, на 5—10 мин; промывают дистиллированной водой; диффе­ренцируют в растворе В, состоящем из 5 мл раствора В и 100 мл бидистиллированной воды, в течение 20—30 с; промывают водопроводной водой; докрашивают раство­ром С в течение 30 с; промывают водой, высушивают на воздухе. Хламидий окрашиваются в ярко-красный цвет, клет­ки патологического материала — в светло-синий, ядра клеток — в темно-синий цвет.

Окраска по Маккиавелло в модификации Здродовского. Готовят три раствора: раствор А (сохраняется в холодильнике в течение нескольких дней) - основной фуксин - 1 г, карболовая кислота - 5 г, этиловый спирт - 10 мл, дистиллированная вода – 100 мл; рас­твор Б - 0,5%-ный водный раствор метиленовой сини; раствор В - 0,5%-ный раствор лимонной или 0,15%-ный раствор уксусной кислоты.

Техника окраски. Препараты быстро фиксируют над пламенем и покрывают на 5 мин свежеприготовленной смесью: раствор А – 10-25 капель, бидистиллирован­ной воды или фосфатный буфер (рН 7,4) - 10 мл; про­мывают дистиллированной водой; около 3 с дифферен­цируют в растворе В; промывают продолжительно дистиллированной водой; быстро окрашивают (10 с) рас­твором Б; промывают проточной водой, высушивают, ис­следуют с использованием иммерсионных систем. Хла­мидий рубиново-красного цвета на светло-голубом фоне. Метод дает хорошие результаты только при окрашива­нии свежих препаратов.

Приложение 2

Окраска акридиновым оранжевым для люминесцентной микроскопии. Готовят жидкость Корнуа - шесть объемов 96-100%-ного этилового спирта, три объема хлороформа, один объем ледяной уксусной кислоты. Фосфатно-цитратный буфер (рН 3,8): лимонная кисло­та - 10 г, Nа₂НРО₄-7Н₂О - 15 г, дистиллированная во­да - 1 л. При наличии Nа₂НРО₄- 12Н₂О проводят пере­расчет:

Nа₂НРО₄7Н₂О НЬ 268,157

Nа₂НР0₄12Н₂0 НЬ 358,157

15 г - 268,157 Х = 15  358,157/268,157 = 20,034

х - 358,157

Маточный раствор акридинового оранжевого: акри­диновый оранжевый — 0,1 г, фосфатно-цитратный бу­фер — 100 мл (может храниться в холодильнике). Рабо­чий раствор акридинового оранжевого готовят в кон­центрации 1: 10 тыс. — 1: 30 тыс. на основе указанного буфера.