Состав набора для выделения днк «днк-сорб-пцр»:

• Лизирующий раствор 30 cм³,

• Отмывочный раствор 1 30 cм³,

• Концентрат для отмывочного раствора 2 20 cм³,

• Суспензия сорбента 2 cм³,

• Буфер для элюции ДНК 4 cм³.

Порядок работы:

1. Приготовить отмывочный раствор 2, для этого в отдельном флаконе смешать 20 cм³концентрата из набора, 80 cм³дистиллированной воды и 100 cм3 96% этанола. Хранить раствор при комнатной температуре в плотно завинчивающемся флаконе.

2. Проверить состояние сорбента – при отстаивании он должен занимать приблизительно половину объема суспензии.

3. В плотно закрывающуюся полипропиленовую пробирку на 1,5 cм³(желательно с завинчивающейся крышкой) внести по 100 мкл предварительно подготовленной исследуемой пробы, отрицательной или положительной пробы, добавить по 300 мкл лизирующего раствора (в каждую пробу отдельным наконечником) и тщательно перемешать пипетированием 3-10 раз.

4. Добавить 15 – 20 мкл ресуспендированного сорбента, хорошо перемешать на вортексе, поставить в штатив на 5-7 мин для полного осаждения сорбента.

5. Осадить сорбент на микроцентрифуге в течение 30 сек при 3-8 тыс. об./мин. Отобрать супернатант из каждой пробирки отдельным наконечником (удобно использовать вакуумный отсос).

6. Добавить по 300 мкл отмывочного раствора 1, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента (если сорбент плохо разбивается разбить его при помощи пипетки), осадить на центрифуге при 4-8 тыс.об./мин в течение 30 сек. Отобрать супернатант из каждой пробирки отдельным наконечником.

7. Добавить по 800 мкл отмывочного раствора 2, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, осадить на микроцентрифуге при 6-10 тыс.об./мин в течение 30 сек, отобрать супернатант.

8. Повторить п. 6, тщательно отобрать супернатант, высушить осадок сорбента в термостате при 65 °С, в течение 5 мин.

9. Ресуспендировать сорбент в 30-40 мкл элюирующего буфера, поместить в термостат на 65°С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.

10. Осадить на микроцентрифуге при максимальных оборотах 1 мин.

Проба готова к постановке ПЦР, супернатант содержит очищенную ДНК.

В качестве отрицательного контроля на этапе выделения ДНК необходимо использовать физраствор или деионизованную воду.

Эффективность выделения ДНК с помощью набора «ДНК-сорб-ПЦР» составляет 30 – 60%.

Клинический материал	Плазма, сыворотка	Соскоб, сперма, фаренгиальные смывы, моча	Биоптат, кровь, фекалии
Число пипетирований	3 раза	5-10 раз	10 раз
Объем сорбента	15 мкл	20 мкл	25 мкл
Скорость осаждения сорбента	8 тыс.об/мин	6 тыс.об./мин	3-4 тыс об./мин
Объем элюента	20-30 мкл	30-40 мкл	40 мкл
Эффективность выделения ДНК	30%	30-40%	50-60%

5.2. Этап 2. Постановка пцр состав набора для проведения пцр-амплификации:

• 5-кратный реакционный буфер .1000 мкл (вязкий прозрачный раствор синего цвета)

• Деионизованная вода .2000 мкл

• Смесь нуклеотидов .500 мкл

• Taq-полимераза .100 мкл

• Смесь праймеров .500 мкл

• Воск для ПЦР .2000 мкл

• Положительный контроль .100 мкл

• Отрицательный контроль 100 мкл

• Минеральное масло 4000 мкл

Набор хранится при минус 20°С в течение года.