37. Стадии концентрирования, обезвоживания, модификации и стабилизации целевых продуктов биотехнологических процессов.

Концентрирование продукта.За отделением продукта следует этап его концентрирования с пом.основных методов – обратного осмоса, ультрафильтрации и выпаривания.Обратныйосмос - концентрируемый р-р помещается в мешок из полупроницаемой мем-ны, снаружи создается осм-ое давление, превышающее осм-ое давление р-ра, в рез-те чего раст-ль начинает вытекать через мем-ну против градиента конц-и раст-го в-ва,обус-вая дальнейшее конц-е р-ра.

Ультрафильтрация- сп-б разд-я в-ва с пом.мемб-ных фильтров.Не требуется изм-е рН,ионной силы р-ра или перевода продукта в др.фазу.

Метод выпаривания -недостаток: для удал-я раств-ля концент-мый р-р следует нагревать. В производ-х усл-х чаще применяются вакуумные испарители, обеспечивающие более щадящий режим конц-ния.Нагревающим агентом служит водяной пар, хотя испол-ся также обогрев жидким теплоносителем или элект-ми нагревателями. Конц-ние методом выпаривания может ограничиваться стадией получ-я сиропообразного р-ра целевого продукта; такая процедура называется упариванием и получаемый продукт относится категории жидких. Дальнейшее освобождение от влаги, остающейся в прод-х после обратного осмоса,ультраф-ции или выпар-ия,достигается путем сушки.

Обезвоживание продукта (сушка) - перспективным методом является обезвоживание в газообразных нагревающих агентах (пар, воздух, углекислый газ, дымовые газы и т. д.), которые с высокой скоростью подаются в сушильный аппарат снизу, а частицы обезвоживаемого продукта парят в этом газовом потоке. Преимущество: возможность регулировать интенсивность массо-тепло-обмена, а также возможность организации непрерывного процесса. Недостаток метода: прилипание продукта к стенкам сушильной камеры.

Модификация продуктов - необходима в тех случаях, когда в рез-те процесса получается лишь "заготовка" целевого продукта. Так, например, пенициллин модиф-ся до полусин-х препаратов, поступающих для прак-го использования каккоммерческие препараты.

Стабилизация продукта - определенная степень обезвоживания сущ-но повышает стабильность активностей фер-в, включая и устойч-ть к нагреваниям. Стабилизация фер-в также достигается доб-ем к препаратам глицерина или углеводов, которые формируют многочисленные водородные связи с аминокислотными остатками, препятствуя тем самым ихденатурированию при нагревании или спонтанной инактивации.

38. Применение и источники ферментов

Фементы - это белки, выполняющие роль катализаторов в живых организмах. Основные функции ферментов - ускорять превращение веществ, регулировать биохимические процессы, в т.ч. в ответ на изменяющиеся условия. 6 классов ферментов: Оксидоредуктазы, Трансферазы, Гидролазы, Лиазы, Изомеразы, Лигазы. Достоинства ферментов:нетоксичность, работают в мягких условиях, не требующих высоких температур, используют доступное сырье (часто отходы).Ферменты по объёму производства занимают 3 место после аминокислот и антибиотиков.Применение ферментов: * В промышленности используется всего около 30 ферментов, хотя известно 2000.Чаще всего используются (и продаются) гидролазы – щелочные и нейтральные протеазы (60%). Они в основном используюся в качестве детергентов при производстве синтетических моющих средств. На втором месте - гликозидазы (30%). Они используются в производстве кондитерских изделий, фруктовых и овощных соков. Основное место среди них занимают глюкоизомераза и глюкозамилаза, применяющиеся при обогащении фруктозой кукурузных сиропов и составляющие около 50% рынка пищевых ферментных препаратов. *Ферменты применяются также в текстильной, кожевенной, целлюлозно-бумажной, медицинской, химической промышленности. *В технологических процессах:- амилаза(источники – бакт, грибы Bacillus? Aspergillusniger, A.oryzae) – гидролиз крахмала до декстринов, мальтозы и глюкозы в спиртовой и пивоваренной промышленности, хлебопечении, получении патоки, глюкозы, - липазы(ист-ки – поджелуд железы животных, семена раст, микроорганизмы – Candidalipolytika, Streptomycesflavogriseus, Aspergilusssp, Saccharomyceslipolytika) – гидролиз жиров и масел в пищевой, медицинской промышленности, сельском, жилищно-коммунальном хозяйстве, бытовой химии,- пектиназа(источники – многие виды микроорганизмов – Aspergillusssp, Fusariumssp, Penicillumspдр)– гидролиз галактуронана, осветление вина и фруктовых соков,- глюкоизомераза(источники – более 80 видов микроорганизмов - Bacillussp., Streptomycesalbus, S. griseus)– изомеризация глюкозы во фруктозу в кондитерской, ликероводочной, безалкогольной промышленности, хлебопечении. - пептидогидролазаисточники – более 80 видов микроорганизмов - Bacillussp., Streptomycesalbus, S. griseus– лизиса (гидролиза) белков в получении аминокислот, производство и получение сыра, мягчение мясных и рыбных изделий, выделка кож, активизация пищеварения. В пивоваренной, винодельческой, пищевой промышленности, в сельском хозяйстве, медицине.- целлюлазы(источники - микроорганизмы -Clostridiumssp, Trichodermsreesei, T. Viridae, Altenariatenuis, Aspergillusoruzae, Fusariumculmorum)– гидролиз целлюлозы до глюкозы. Производство пищевых и кормовых препаратов, этанола, глюкозо-фруктозных сиропов. Спиртовая, пивоваренная, пищеконцентратнная промышленность. Хлебопечение, коромопроизводство.- фруктофуранозилаза(источники – микроорганизмы - Aspergillusssp, Penicillumsp, Fusariumssp, E/ coli и др )– инверсия сахарозы. Кондитерская, ликероводочная, безалкогольная промышленность, производство сиропов.Источники ферментов: для выделения ферментов исп-ют природные объекты, в которых содержание энзима не менее 1 процента. Для крупномаштабного получения пригодны только некот растит организмы на определенной фазе их развития, отдельные ткани и органы животных (поджелуд железа, слизистая оболочка ЖКТ, сычуг, семенники). Практич неограниченным источником ферментов явл микроорганизмы (бакт, грибы, дрожжи), содержащие набор большинства известных энзимов, кол-во кот можно повысить методами мутагенеза, селекции и индукции биосинтеза.

39. ТЕХНОЛОГИЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Выделение и очистка фермента как из культуры микроорганизма (выращенного любым способом), так и из других природных источников весьма трудоемкая и дорогостоящая процедура, поэтому, если фермент можно использовать в виде неочищенного препарата, его не очищают. В промышленности широко применяют коммерческие препараты ферментов, чистота которых составляет всего 0,1 % (т.е. 99,9 % составляют примеси). К таким отраслям относятся спиртовая, кожевенная, текстильная промыш­ленность, а также сельское хозяйство, производство бытовой хи­мии. Например, ферментный препарат, употребляемый в пивоварении, представляет собой высушенную биомассу плесневых грибов. В большинстве отраслей пищевой промышленности, практике научных исследований и особенно в медицине используют только очищенные препараты ферментов, частично или полностью освобожденные от балластных веществ и полностью охарактеризованные в отношении их специфичности и физико-химических свойств. Исходным материалом для получения препаратов ферментов служат: биомасса продуцента, фильтрат культуральной жидкости, экстракт из культуры микроорганизма или из тканей и органов растений и животных, из которых готовят препараты раз­личной степени очистки.

Неочищенные ферментные препараты получают путем высушивания в мягком режиме культуры микроорганизмов вместе с остатками питательной среды. Такие препараты получают и путем упаривания экстракта из культуры продуцента, выращенного поверхностным способом, или из фильтрата культуральной жидкости (в случае глубинного выращивания микроорганизмов). Распространен также метод ацетоновых порошков, состоящий в осаждении и быстром обезвоживании при температуре не выше -10 °С тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты. Технические препараты ферментов представляют собой либо высушенные до порошко­образного состояния продукты, либо жидкие концентраты, обычно характеризующиеся 50 %-м содержанием сухой массы веществ.

Для успешного выделения ферментов из клеточного содержимого необходимо очень тонкое измельчение исходного материала вплоть до разрушения субклеточных структур: лизосом, митохондрий, ядер и др. Для этого используют специальные мельницы и гомогенизаторы, а также ультразвук, метод попеременного замораживания и оттаивания ткани. Для высвобождения ферментов из мембранных структур клетки к гомогенатам добавляют небольшие количества детергентов или обрабатывают их энзимами — лизоцимом, целлюлазой, лецитиназой С. Особое внимание при выделении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях, исключающих денатурацию белка (нейтральные значения рН, стабилизирующие добавки в виде белков, солей и специальных соединений).

В зависимости от свойств выделяемого фермента и сопутствующих ему балластных веществ при получении очищенных препаратов ферментов комбинируют различные приемы и методы, такие, как термическое фракционирование, осаждение органическими растворителями, солями и тяжелыми металлами, фильтрация на молекулярных ситах, ионообменная хроматография, электрофорез, изоэлектрофокусирование.

На заключительных этапах очистки часто используют аффинную хроматографию (биоспецифическая хроматография, хроматография по сродству), которая основана на способности ферментов избирательно связывать те или иные лиганды — субстраты,

Очищенные ферментные препараты хранят при низкой температуре (до -80 °С). Для стабилизации ферментов в их препараты добавляют коферменты и субстраты. Ферментные препараты для промышленного применения стабилизируют, добавляя глицерин, моносахариды, дисахариды (глюкоза, сахароза, лактоза), HS-co- единения (цистеин, глутатион, меркаптоэтанол, дитиотреитол и др.), отдельные аминокислоты, желатину и другие белки-напол­нители.

Существенно, что из 2003 включенных в список известных в настоящее время ферментов более 1500 выделено и в той или иной степени очищено; это служит не только базой для изучения физико-химических основ ферментативного катализа, но и фундаментом для совершенствования химического производства и промыш­ленности.