63. Получение инсулина и соматостатина на основе методов генетической инженерии.

Инсулин -гормон поджел-й железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень саха­ра в крови. Недостаток этого гормона в организме приводит к одному из тяжелейших заболеваний — сахарному диабету, кото­рый как причина смерти стоит на третьем месте после сердечно­сосудистых заболеваний и рака.

Работы по генно-инженерному получению инсулина начались более 20 лет назад. В 1978 г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клет­ках Е. coli (рис. 28). Каждый из полученных синтетических генов подстраивался к 3'-концу гена фермента β-галактозидазы и вводил­ся в векторную плазмиду (pBR322). Клетки Е. coli, трансформиро­ванные такими рекомбинантными плазмидами, производили гиб­ридные (химерные) белки, состоящие из фрагмента β-галактози­дазы и А или В пептида инсулина, присоединенного к ней через остаток метионина. При обработке химерного белка бромцианом пептид освобождается. Однако замыкание дисульфидных мостиков между образованными цепями инсулина происходило с трудом.

В 1981 г. синтез-н ген-аналог проинсулина — мини-С-про-инсулин, в котором 35-звенный С-пептид был заменен на сег­мент из шести АК: арг-арг-гли-сер-лиз-арг и показана его экспрессия в Е. coli.

В 1980 г. У.Гилберт с сотрудниками выделили мРНК инсулина из опухоли β-клеток поджелудочной железы крысы и с помощью обрат­ной транскриптазы получили с нее кДНК. Полученную кДНК встрои­ли в плазмиду pBR322 Е. coli, в среднюю часть гена пенициллиназы. Рекомбинантная плазмида содержала информацию о структуре про­инсулина. В результате трансляции мРНК в клетках синтезировался гибридный белок, содержащий последовательности пенициллина­зы и проинсулина, который выщепляли из такого белка трипсином.

Соматотропин (или гормон роста человека ГРЧ) секретируется передней долей гипофиза. Впервые он был выделен и очищен в 1963 г. из гипофиза. Его недостаток приводит к заболеванию —карликовости (1 случай на 5000 человек). Гормон обладает видовой специфичностью. Ранее его получали из гипофи­за трупов, но в недостаточном количестве. В настоящее время ГРЧ синтезируют методами генетической инженерии в специаль­но сконструированных клетках бактерий. Будучи синтезированным в клетках Е. coli, ГРЧ содержит дополнительный остаток метионина на H₂N-концe молекулы. Биосинтез ГРЧ из 191 аминокислот­ного остатка был осуществлен в 1979 г. Сначала клонировали двунитевую кДНК; далее путем расщеп­ления получали последовательность, кодирующую аминокислот­ный порядок гормона, за исключением первых 23 аминокислот, — с фен (—NH₂) до лей (23), и синтетический полинуклеотид, со­ответствующий аминокислотам от первой до двадцать третьей со стартовым ATG-кодоном в начале. Затем два фрагмента объеди­няли и подстраивали к паре lac-промоторов и участку связыва­ния рибосом. Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл культуры, что составляет 100000 молекул гормона на клетку. Полученный гормон на конце полипептидной цепи содержал дополнительный остаток метионина и обладал значительной биологической активностью. С 1984 г. после серьезных клинических испытаний на токсичность компанией «Генетек» (Сан-Франциско) было начато широкомасштабное производство бактериального соматотропина.

Огромный интерес представляют выделение и синтез полипептида, обладающего полной биологической активностью гипо-таламического рилизинг-фактора соматотропина (СТГ-РФ). Вве­дение этого фактора способно компенсировать недостаток сома­тотропина. Таким образом, наличие СТГ-РФ и самого гормона, полученных в генетически сконструированных бактериальных клет­ках, очень важно для успешного лечения заболеваний, обуслов­ленных недостатком этого гормона, и ряда патологических забо­леваний, таких, как некоторые формы диабета, регенерация тка­ней после ожогов и др.

64. Синтез соматотропина.Соматотропин(или гормон роста человека ГРЧ) секретируется передней долей гипофиза. Впервые он был выделен и очищен в 1963г. из гипофиза.Его недостаток приводит к заболеванию-гипофизарной карликовости (1 случай на 5000 человек). Соматотропный гормон нестойкий. Время его  полураспада равно 20-25 минутам.Синтез соматотропного гормона контролируется  гипоталамусом. В нем вырабатываются так называемые рилизинг факторы. Соматолиберин стимулирует синтез СТГ, а соматостатин блокирует. Сам соматотропный гормон оказывает свое действие на организм не напрямую, а через гормоны-посредники. Их называют инсулиноподобными ф-ми роста (ИФР, соматомедины). Именно ИФР-1, который обр-ся в печени, явл-ся одним из маркеров при заболеваниях, связанных с соматотропным гормоном.Секреция соматотропного гормона приходится в основном на период сна (около 70 %).

Синтез и секреция соматотропного гормона увеличиваются в следующих случаях:физическиенагрузки;стресс;прием белковой пищи;введение аминокислот (аргинина и лейцина); продолжи-тельное голодание; нарушение всасывания пищи; снижают секрецию соматотропного гормона;повышенный уровень сахара в крови;повышенный уровень холестерина в крови. Соматотропин оказывает мощное анаболическое и антикатаболическое действие, усиливает синтез белка и тормозит его распад, а также способст-вует снижению отложения подкожного жира, усилению сгорания жира и увеличению соотношения мышечной массы к жировой. Кроме того, соматотропин принимает участие в регуляции углеводного обмена — он вызывает выраженное повышение уровня глюкозы в крови и явл-ся одним из контринсулярных гормонов, антагонистов инсулинапо д-вию на углеводный обмен. Многие эффекты гормон роста вызывает непосредственно, но значительная часть его эффектов опосредуется инсулиноподоб-ными ф-ми роста, главным образом IGF-1 (ранее его называли соматомедином С), который вырабатывается под д-вием гормона роста в печени и стимулирует рост большинства внутренних органов. Рецептор гормона роста — трансмембранный белок, относящийся к суперсемейству рецепторов с тирозинкиназной активностью. Согласно данным большинства исследователей при взаимодействии с одной молекулой гормона происходит объединение двух молекул рецептора (димеризация), после чего рецептор активируется, и его внутриклеточный домен фосфори-лирует сам рецептор и основной белок-мишень — янус-киназу (JAK-2).Дальнейшая передача сигнала идет несколькими путя-ми — через белки STAT янус-киназаактивирует транскрипцию ряда генов, через белок IRS (субстрат инсулинового рецептора) осущ-ся влияние на тр-т глюкозы в клетки и др. Секреция гормона роста, как и многих др. гормонов, происходит периодически и имеет несколько пиков в течение суток (обычно пик секреции наступает через каждые 3-5 часов). Наиболее высокий и предска-зуемый пик наблюдается ночью, примерно через час-два после засыпания.Главные регуляторы секреции гормона роста — пептидные гормоны гипоталамуса (соматостатин и соматолиберин), которые выделяются нейросекреторными клетками гипоталамуса в портальные вены гипофиза и д-ют непосредственно на соматотро-пы. Стимулируют секрецию гормона роста:-соматолиберин; грелин;сон;физическиеупражнения;потребление определенных аминокислот (аргинин, орнитин, лизин, глутамин); увеличение секреции андрогенов в пубертатный период (у самцов в семенниках, а у самок в коре надпочечников); гипогликемия. При гипогликемии уровень соматотропина в крови резко повышается — это один из естественных физиологических механизмов быстрой коррекции гипогликемии.Подавляют секрецию гормона роста: соматостатин; высокаяконц-ция гормона роста и инсулиноподоб-ного фактора роста IGF-1 в плазме крови (д-вие по принципу отриц. обратной связи на гипоталамус и переднюю долю гипофиза);гипергликемия; высокое содержание свободных жирных кислот в плазме крови; глюкокортикоиды;эстрадиол и др.эстрогены.На секрецию гормона роста влияют также некоторые ксенобиотики.Избыток.У взрослых патологическое повышение уровня соматот-ропина или длительное введение экзогенного соматотропина в дозах, характерных для растущего организма, приводит к утолще-нию костей и огрублению черт лица, увеличению размеров язы-ка — акромегалии. Сопутствующие осложнения — сдавливание нервов (туннельный синдром), уменьшение силы мышц, повышение инсулиноустой-чивости тканей.Обычная причина акромегалии — аденомапередней доли гипофиза. Обычно аденомы возни-кают в зрелом возрасте, но при редких случаях их возникновения в детстве набл-сягипофизарный гигантизм.Недостаток.Недостаток гормона роста в детском возрасте связан в основном с генетическими дефектами и вызывает задержку роста гипофизарный нанизм, а иногда также полового созревания.