47. Дифференцировка клеток как основа каллусогенеза

Культура изолированных тканей обычно представлена каллусными и гораздо реже опухолевыми тканями. Каллусная ткань об­разуется в результате повреждения на целых растениях, а также в стерильной культуре на эксплантах — фрагментах ткани или органа, используемых для получения первичного каллуса. Возникно­вение каллуса связано с неорганизованным делением (пролифе­рацией) деф-х клеток.

Деф-ка — основа создания каллусной ткани. В процессе дифференцировки клетки теряют способность делиться. Деф-ка — это возвращ-е кл-к в меристематическое сост-е, при кото­ром они сох-т спос-ть к дел-ю. У интактных растений деф-ка и индукция каллусогенеза возн-т вслед­ствие образ-я раневых гормонов (травматиновая к-та) при мех-ом повреждении. Обяз-ое усл-е дедифферен-цировки тканей экспланта и превращения их в каллусные клетки, помимо повреждения, — присутствие ауксинов и цитокининов. Среди ауксинов чаще всего используют 2,4-D (2,4-дихлорфенок-сиуксусную кислоту), ИУК (индолил-3-уксусную кислоту), НУК (а-нафтилуксусную кислоту), причем наибольшую активность проявляет 2,4-D. Из цитокининов в искусственные питательные среды обычно вносят кинетин, 6-БАП (6-бензиламинопурин), зеатин. Наиболее активны 6-БАП и зеатин.

Во время процесса дедифференциации, который у всех клеток сходен, клетки должны утратить характерные черты исходной ткани. В первую очередь они теряют запасные вещества — крахмал, бел­ки, липиды. В них разрушаются специализированные клеточные органеллы, в частности хлоропласта, но возрастает число амилопластов. Кроме того, разрушается аппарат Гольджи, перестраи­ваются эндоплазматический ретикулюм и элементы цитоскелета.

Через несколько часов после перенесения экспланта в условия invitro начинается новый синтез белка. Он связан, вероятно, с механическим повреждением и действием гормонов, сохранив­шихся в экспланте с момента его изоляции из растения. Когда данные гормоны израсходуются, синтез белка прекращается. Если в это время клетки будут культивироваться на питательной среде, содержащей ауксины и цитокинины, то начнется каллусогенез, т.е. в результате дедифференцировки и деления клеток будет образовываться первичный каллус. Таким образом, специализи­рованная клетка растительной ткани становится каллусной в ре­зультате дедифференцировки, т.е. восстановления у нее способ­ности к делению.

48. Типы культивирования клеток и тканей.Культив-е кл-к представляет собой процесс, посредством которого отдельные кл-ки (или единственная кл-ка) прокариот и эукариот искус-но выращ-тся в контролируемых усл-х. На практике термин «культура кл-к» относится к выращ-ю кл-к, относящихся к одной ткани, полученных от многокл-х эукариот, чаще всего жив-х. Этапы: Выделение кл. - для культ-ия вне организма живые кл. могут быть получены несколькими способами: кл. могут быть выделены из крови, но к росту в культуре способны только лейкоциты; могут быть выделены из мягких тканей с помощью таких ферментов как коллагеназа, трипсин, разрушающих внеклеточный матрикс. Культуры кл., взятых непосредственно от объекта, называются первичными.Существуют иммортализованные («бессмертные») линии кл., способные размножаться бесконечно.Культивирование кл.–кл. выращивают в спец. пит-х средах, при пост. Темп., а для кл. млекопитающих обычно необходима также газовая среда, поддерживаемая в инкубаторе клеточных культур. Пит. Ср. для разных культур кл. различаются по составу, pH, концентрации глюкозы, составу факторов роста. Факторы роста в средах добавляют вместе с сывороткой крови. Одним из факторов риска при этом является возможность заражения культуры кл. вирусами. Кл.можно выращивать в суспензии, либо в адгезивном состоянии. Некоторые кл. (кл. крови) в естественных условиях сущ. во взвешенном состоянии. Существуют также линии кл., искусственно измененных так, чтобы они не могли прикрепляться к поверхности; это сделано для того, чтобы увеличить плотность кл. в культуре. Для выращивания адгезивных клеток требуется поверхность, например, культура ткани, или пластик, покрытый элементами внеклеточного матрикса для улучшения адгезивных свойств, а также для стимулирования роста и дифференцировки. Особенности выращивания клеток.При выращивании кл., из-за постоянного деления может возникнуть их переизбыток в культуре. В результате чего - следующие проблемы: Накопление в питательной среде продуктов выделения, в том числе токсичных, омертвевших клеток, прекративших жизнедеятельность. Скопление большого количества клеток оказывает негативное влияние на клеточный цикл, рост и деление замедляются, а клетки начинают стареть и отмирать.Пассажированиекл.- (разделение) —отбор небольшого количества кл.для выращивания в другом лабораторном сосуде. Если культура быстро растет, это необходимо делать регулярно, поскольку в среде истощаются питательные вещества и накапливаются продукты метаболизма.