47. Иммунофенотипирование и цитогенетические исследования в диагностике болезней крови. Иммунофенотипирование

Более высокий, второй уровень диагностики онкогематологических заболеваний включает использование методов иммунофенотипирования для более точного установления природы патологических клеток при опухолевых заболеваниях кроветворной и лимфоидной тканей, в первую очередь лимфопролиферативных заболеваний (ОЛЛ, ХЛЛ, неходжкинские злокачественные лимфомы).

Успехам, достигнутым в иммунофенотипировании гемобластозов, в немалой степени способствовало создание гибридомной технологии и получение моноклональных антител к широкому спектру линейно-специфических, дифференцировочных и активационных антигенов Т- и В- лимфоцитов, гранулоцитов, клеток моноцитарно/макрофагального, мегакариоцитарного и эритробластического ряда, стволовых кроветворных клеток и различных категорий гемопоэтических клеток-предшественников. Многочисленные лейкоцитарные антигены человека, в том числе открытые в последние годы, представлены в опубликованной в 2002 г. Международной классификации в виде 247 кластеров дифференцировки (CD) [8].

При диагностике злокачественных лимфом для определения антигенного профиля трансформированных клеток в гистологических препаратах (парафиновых или криостатных срезах) в настоящее время наряду с непрямым пероксидазным методом применяют новые высокочувствительные системы визуализации реакции антиген-антитело: EPOS, LSAB, EnVision со щелочной фосфатазой в качестве метки антител [9]. В большинстве гематологических и клинико-диагностических лабораторий используют непрямой или прямой иммунофлуоресцентный метод.

Результаты реакции регистрируют с помощью обычного люминесцентного микроскопа или проточных цитофлуориметров.

Один из новейших подобных приборов — проточный цитофлуориметр FACSCaliburTM производства фирмы Becton Dickinson (США) — позволяет проводить регистрацию до 6 оптических параметров клеток, включая 4 параметра флуоресценции с использованием двухлазерной оптической системы. С его помощью анализируется состав имеющихся в пробе клеточных популяций и имеется возможность выделять (сортировать) отдельные субпопуляции клеток на основе их фенотипических характеристик. Следует отметить высокую скорость анализа огромного количества клеток, а также чувствительность и высокую точность измерений. Сложности возникают при исследовании гетерогенных клеточных популяций, например при невысоком содержании в объекте (в костном мозге) бластных клеток при МДС, «малопроцентных» ОЛ или при определении минимальной резидуальной болезни после проведенной терапии. Высокая стоимость приборов подобного типа (от 70 до 400-600 тыс. долларов) не позволяет широко использовать их в клинической практике.

В нашей лаборатории при диагностических исследованиях мы с самого начала шли иным путем: усовершенствовали методы (РАР, АРААР, АВС-АР), позволяющие при обычной светооптической микроскопии изучать иммунофенотипические характеристики отдельных популяций клеток, выделенных в градиенте плотности фиколл-верографина (d=1,077) из периферической крови, пунктатов и биоптатов костного мозга и лимфатических узлов [9, 10]. В дальнейшем разработали методы, позволяющие выявлять спектр антигенов поверхностных мембран и цитоплазмы клеток непосредственно в мазках крови и костного мозга, что позволило проводить иммунофенотипирование острых лейкозов не только у жителей г. Киева и Киевской области, но и у больных из других регионов Украины.

Преимущество подобного подхода — иммунофенотипирование возможно при точной идентификации цитоморфологических признаков изучаемых клеток и их низком содержании (5-10%) в исследуемом объекте. Недостатки — трудоемкость, относительная длительность (до двух суток), привлечение технического персонала и высококвалифицированных специалистов для постановки диагноза, который устанавливается одним исследователем-гематологом с учетом данных цитоморфологического, цитохимического анализов и иммунофенотипирования.