Средства анализа

При выполнении методики используют следующие средства:

чашки Петри, ГОСТ 25336-82;

пробирки вместимостью 20 см³, ГОСТ 1770-74;

пипетки градуированные, 1 см³ и 5 см³, ГОСТ 29227-91;

питательные среды:

среда №1 – для определения бактерий семейства Enterobacteriacеae и Staphilococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa;

среда №2 – Сабуро для выращивания грибов;

среда №3 - для идентификации бактерий семейства Enterobakteriaceae;

среда №4 - агар Эндо сухой (для выделения бактерий семейства Enterobaсteriaceae);

среда №5 – висмут сульфит агар сухой (для выделения бактерий семейства Enterobakteriaceae);

среда №6 – для определения ферментации глюкозы;

среда №7 – для определения восстановления нитратов в нитриты;

среда №8 – для выращивания Pseudomonas aeruginosa, Staphilococcus aureus;

среда №9 – для выявления пигмента пиоцианина;

среда №10 – для идентификации Staphilococcus aureus;

феноловый красный, ТУ 6-09-5170-84;

малахитовый зеленый, ТУ-6-09-1551-77;

реактив Грисса, ГОСТ 4517-75 (для определения нитритов);

реактив на цитохромоксидазу;

вазелин, ГОСТ 5774-51;

вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.

МЕТОД АНАЛИЗА

Испытание на микробиологическую чистоту воды дистиллированной включает количественное определение жизнеспособных бактерий и грибов, а также выявление бактерий семейства Enterobacteriacеae и Pseudomonas aeruginosa, Staphilococcus aureus при высеве на плотные питательные среды.

Требования безопасности

При выполнении анализа по определению микробиологической чистоты воды дистиллированной необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе в микробиологической лаборатории в соответствии с СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV группы патогенности».

Требования к квалификации оператора

К выполнению данной методики допускаются лица со средним и высшим медицинским образованием, усвоившие требования общей техники безопасности и имеющие навыки работы в микробиологической лаборатории.

УСЛОВИЯ ВЫПОЛНЕНИЯ АНАЛИЗА

При выполнении данной методики должны быть соблюдены следующие условия:

вода дистиллированная должна быть свежеприготовленной;

питательные среды и реактивы готовят строго по нижеприведенным прописям.

Подготовка к анализу

Перед выполнением анализа должны быть проведены следующие работы:

1. Приготовление питательных сред.

Среда № 1:	Среда № 2:
пептон ферментативный сухой - 10 г, ГОСТ 13805-76; натрия хлорид - 5 г, ТУ 6-09-5222-85; глюкоза - 1 г, ГОСТ 6038-79; агар микробиологический - 13 г, ГОСТ 17206-71; мясная вода (1:2) - 1000 см3, ГОСТ 20729-75; рН после стерилизации 7,3  0,2.	Пептон ферментативный сухой - 10 г; Глюкоза - 40 г; агар микробиологический - 13 г; вода дистиллированная - 1000 см3; рН после стерилизации (5,60,2).
Среда № 3:	Среда № 6:
пептон ферментативный сухой - 10 г, ГОСТ 13805-76; натрий фосфат двузамещенный - 7,5 г, ГОСТ 11773-76; калий фосфат однозамещенный - 2,5 г, ГОСТ 4198-75; глюкоза – 10 г; феноловый красный - 0,08 г; малахитовый зеленый - 0,015 г; мясная вода (1:2) - 1000 см3; рН после стерилизации (7,30,2).	Пептон ферментативный сухой - 10 г; Натрия хлорид - 5 г; Глюкоза - 40 г; Феноловый красный - 0,08 г; Мясная вода (1:2) - 1000 см3; рН после стерилизации (7,20,2).
Среда № 7:	Среда № 8:
пептон ферментативный сухой - 5 г; натрия хлорид - 5 г; калия нитрат - 1,5 г, ГОСТ 4144-79; вода дистиллированная - 1000 см3; рН после стерилизации (7,30,2).	Пептон ферментативный сухой - 10 г; Натрия хлорид - 5 г; Калия фосфат двузамещенный -2,5г,ТУ 6-09-4689-78; Глюкоза - 2,5 г; вода дистиллированная - 1000 см3; рН после стерилизации (7,30,2).
Среда № 9:	Среда № 10:
пептон ферментативный сухой 20 г; магния хлорида безводного 1,4 г; калия сульфата безводного 10 г ГОСТ 4145-74; глицерин 10 г ГОСТ 6829-77; агар микробиологический 15 г; вода дистиллированная 1000 см3; рН (7,20,2).	Пептон ферментативный сухой - 10 г; Натрия хлорид - 75 г; Маннит - 10 г, ГОСТ 8321-74; Феноловый красный - 0,025 г; агар микробиологический - 15 г; вода дистиллированная - 1000 см3; рН после стерилизации (7,40,2).

Среды №№ 4 и 5 готовят согласно прописи на этикетке.

Среды стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром под давлением при температуре 121 ^оС в течение 15 минут.

2. Приготовление растворов и реактивов.

1/15 мол Фосфатный буферный раствор с хлоридом натрия и пептоном:

калия фосфат однозамещенный - 3,56 г;

натрия фосфат двузамещенный - 7,23 г, ГОСТ 11773-76;

натрия хлорид - 4,3 г;

пептон ферментативный сухой - 1 г;

вода дистиллированная - 1000 см³.

Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром под давлением при температуре – 121 ^оС в течение 15 минут. Раствор хранят при температуре от 4 до 10 ^оС.

Малахитовый зеленый, 0,5 % раствор:

малахитовый зеленый - 0,5 г;

вода дистиллированная - 1000 см³.

Навеску красителя переносят в стеклянный флакон, прибавляют стерильную горячую воду, помещают на сутки в термостат при температуре 37 ⁰С, периодически встряхивая.

Феноловый красный, 1 % раствор:

феноловый красный - 1 г;

раствор едкого натра (0,1 моль/л) - 28,2 см³;

вода дистиллированная - 100 см³.

Навеску индикатора растирают в ступке, прибавляя небольшими порциями раствор едкого натра. Полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят объем раствора водой до метки. Хранят во флаконе из нейтрального светозащитного стекла при температуре от 4 до 10 ^оС.

Реактив Грисса:

раствор № 1 - 0,5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 30 см³ ледяной уксусной кислоты. К полученному раствору добавляют 100 см³ воды, фильтруют. Раствор годен 1 месяц;

раствор № 2 - 0,1 г 1-нафтиламина, ГОСТ 8827-74, растворяют в 100 см³ кипящей воды. Охлаждают. К полученному раствору добавляют 30 см³ ледяной уксусной кислоты, ГОСТ 61-75, фильтруют. Раствор годен в течение 7 суток.

Перед употреблением растворы № 1 и № 2 смешивают в соотношении 1:1.

Реактив на цитохромоксидазу:

раствор № 1 – 1 % спиртовый раствор нафтола–1, ГОСТ 5838-79.

раствор № 2 – 1 % раствор N,N–диметил–р-фенилендиамина дигидрохлорида, ТУ 6-09-1903-77.

Растворы № 1 и № 2 смешивают в соотношении 2:3. Раствор годен в течение 14 суток при хранении во флаконах из нейтрального светозащитного стекла при температуре (4-10) ^оС.