2.Способы получения энергии бактериями (дыхание, брожение). Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

В среде обитания бактерий кроме биосинтетического должен находиться и энергетический материал. По способу получения энергии бактерии также принято делить на две группы: хемотрофы и фототрофы . Хемотрофы используют энергию окисления различных соединений. В зависимости от окисляемого субстрата среди хемотрофных организмов выделяют хемолитотрофы и хемоорганотрофы . Фототрофы для удовлетворения энергетических потребностей используют энергию света.

Способы получения энергии бактериями (дыхание, броже­ние). Методы культивирования анаэробов. Дыхание, или биологическое окисление, основано на окисли­тельно-восстановительных реакциях, идущих с образованием АТФ-универсального аккумулятора химической энергии. Энергия необходима микробной клетке для ее жизнедеятельности. При дыхании происходят процессы окисления и восстановления: окисление — отдача донорами (молекулами или атомами) водорода или электронов; восстановление — присоединение водо­рода или электронов к акцептору. Акцептором водорода или электронов может быть молекулярный кислород (такое дыхание называется аэробным) или нитрат, сульфат, фумарат (такое дыхание называется анаэробным — нитратным, сульфатным, фумаратным). Анаэробиоз (от греч. aer — воздух + bios — жизнь) — жизнедеятельность, протекающая при отсутствии сво­бодного кислорода. Если донорами и акцепторами водорода яв­ляются органические соединения, то такой процесс называется брожением. При брожении происходит ферментативное расщепление органических соединений, преимущественно углеводов, в анаэробных условиях. С учетом конечного продукта расщепления углеводов различают спиртовое, молочнокислое, уксуснокислое и другие виды брожения. По отношению к молекулярному кислороду бактерии можно разделить на три основные группы: облигатные, т.е. обязатель­ные, аэробы, облигатные анаэробы и факультативные анаэробы. Методы культивирования анаэробов. Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, соз­дать условия анаэробиоза, т. е. пониженного содержания кислорода в среде и окружающем ее пространстве. Это достигается применением физических, химических и био­логических методов. Физические методы. Основаны на выращивании мик­роорганизмов в безвоздушной среде, что достигается: 1) посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества; 2) посевом микроорганизмов в глубину плотных пи­тательных сред; 3) механическим удалением воздуха из сосудов, в ко­торых выращиваются анаэробные микроорганизмы; 4) заменой воздуха в сосудах каким-либо индиффе­рентным газом. В качестве редуцирующих веществ обычно использу­ют кусочки (около 0,5 г) животных или растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Эти ткани связывают растворенный в среде кис­лород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содер­жание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10—15 мин, а затем быстро охлаждают и зали­вают сверху небольшим количеством стерильного вазе­линового масла. Высота слоя масла в пробирке около 1 см. В качестве легко окисляемых веществ используют глю­козу, лактозу и муравьинокислый натрий. Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующи­ми веществами является среда Китта — Тароцци, кото­рая используется с успехом для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэ­робов. Посев микроорганизмов в глубину плотных сред про­изводят по способу Виньяль — Вейона, который состоит в механической защите посевов анаэробов от кислорода воздуха. Берут стеклянную трубку длиной 30 см и диа­метром 3—6 мм. Один конец трубки вытягивают в ка­пилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50°С питательным агаром засевают исследуемый материал. Затем насасывают засеянный агар в стерильные трубки Виньяль — Вейона. Капилляр­ный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов. Для выде­ления отдельной колонии трубку надрезают напильни­ком, соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ло­мают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальней­шего выращивания и изучения в чистом виде. Удаление воздуха производят путем его механическо­го откачивания из специальных приборов — анаэростатов, в которые помещают чашки с посевом анаэробов. Переносный анаэростат представляет собой толстостен­ный металлический цилиндр с хорошо притертой крыш­кой (с резиновой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса. Замену воздуха индифферентным газом (азотом, во­дородом, аргоном, углекислым газом)  можно производить в тех же анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона. Химические методы. Основаны на поглощении кисло­рода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэростате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия Na₂S20₄. Биологические методы. Основаны на совместном вы­ращивании анаэробов со строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шири­ной около 1 см. Получается два агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону агаровой пластинки засе­вают аэроб, например, часто используют S. aureus или Serratiamarcescens. На другую сторону засевают ана­эроб. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размно­жаться аэробы. После того, как весь кислород в прост­ранстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3—4 сут). В целях сокращения воздуш­ного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем.  Комбинированные методы. Основаны на сочетании фи­зических, химических и биологических методов создания анаэробиоза.

Выделение чистой культуры анаэробов

I этап — обогащение на среде Китт — Тароцци, предварительно прокипячен­ной в течение 30 минут. После посева среду прогревают 15 минут при 80°С для уничтожения вегетативных форм, споры анаэробов при этом сохраняются. II этап — получение изолированных колоний На средах Китт — Тароцци обнаружи­вается помутнение с пузырьками газа. Выделение чистой культуры проводится по одному из следующих методов:

А) по Цейсслеру — каплю материала со среды Китт — Тароцци засевают в чашку с кровяным агаром и распределяют материал шпателем, этим же шпате­лем производят посев во второй и третьей чашках;

Б) по Вейнбергу: каплю материала со среды Китт — Тароцци переносят в растопленный и слегка остуженный сахарный агар, затем набирают в трубки Виньял — Вейона и инкубируют в термостате. Ш этап — выделение чистой куль­туры на среде Китт — Тароцци.

3. Рост и размножение бактерий. Фазы размножения бактерий в замкнутой среде (периодическая культура). Непрерывное культивирование. Промышленное культивирование бактерий.

При размножении микробной клетки наиболее важные процессы происходят в ядре (нуклеоиде), содержащем всю генетическую информацию в двунитевой молекуле ДНК. Репликация ДНК происходит

полуконсервативным способом, обеспечивающим равномерное распределение генетического материала между дочерними клетками.Надежноеть процесса репликации и правильность расхождения (сегрегация) дочерних цепей обеспечивается связью ДНК с цитоплазматической мембраной. Репликация начинается в определенной точке (локус) ДНК и происходит одновременно в двух противоположных направлениях. Синтез дочерних нитей ДНК идет ступенчато, короткими фрагментами, равными 1-2 тыс. нуклеотидов, которые ≪сшиваются≫ специальным ферментом лигазой. Параллельно с репликацией ДНК начинается образование межклеточной (поперечной) перегородки. Вначале с обеих сторон клетки происходит врастание двух слоев цитоплазматической мембраны. Затем между ними синтезируется пептидогликан. Этот процесс чувствителен к действию некоторых антибиотиков (пенициллинов), ингибирующих

синтез пептидогликана. В период репликации ДНК и образования перегородки микробная клетка непрерывно растет. Наряду с пептидогликаном синтезируются биополимеры, входящие в состав цитоплазматической мембраны,рибосом и цитоплазмы. На последней стадии дочерние клетки

отделяются друг от друга. В этом период у грамотрицательных бактерий синтезируется наружная мембрана, которая встраивается между двумя слоями пептидогликана межклеточной перегородки. В том случае,

когда разделившиеся бактериальные клетки сохраняют межклеточные связи, образуются цепочки, состоящие из клеток шаровидных или палочковидных форм (стрептококки и стрептобактерии).

Подавляющее большинство актиномицет размножается путем фрагментации нитевидных клеток с образованием палочковидных или кокковидных форм. Облигатные внутриклеточные паразиты риккетсии и хламидии размножаются неодинаковыми способами. Риккетсии размножаются

так же, как и бактерии, путем бинарного деления. Хламидии проходят определенный цикл развития. Элементарные тельца,попадая в вакуоль чувствительной клетки, преобразуются в вегетативные

формы— инициальные или ретикулярные тельца, которые способны к делению. После нескольких делений они преобразуются в промежуточные формы, из которых формируется новое поколение

элементарных телец. После разрыва стенки вакуоли и разрушения клетки хозяина элементарные тельца освобождаются, и весь цикл повторяется в других клетках. Продолжительность цикла

составляет 40-48 ч.

У микоплазм основными репродуцирующимися морфологическими единицами являются мелкие элементарные тела сферической или овоидной формы величиной 130-220 нм, которые размножаются путем

фрагментации или почкования. У некоторых видов микоплазм отмечается образование сравнительно крупных шаровидных тел, от которых отпочковываются дочерние клетки. Клетки микоплазм могут размножаться также поперечным делением, если оно происходит синхронно с репликацией ДНК. При нарушении синхронности образуются мононуклеоидные нитевидные клетки, которые в последующем

делятся на кокки. Наплотных питательных средах бактерии образуют скопления клеток,называемые к о л о н и я м и . Внешний вид колоний у многих бактерий настолько характерен, что может служить одним из дифференциальныхпризнаков для их идентификации. Колонии разных видов отличаются по своим размерам, форме, поверхности, окраске, прозрачности и др. На жидких средах рост бактерий характеризуется образованием пленки на поверхности питательной среды, равномерного помутнения,либо осадка.

I — исходная стационарная фаза начинается после внесения бактерий в питательную среду. В течение данной фазы число бактериальных клеток не увеличивается (рис. 4.2, I).

II — лаг-фаза, или фаза задержки размножения характеризуется началом интенсивного роста клеток, но скорость их деления остается невысокой. Две первые фазы можно назвать периодом адаптации бактериальной популяции, продолжительность которого определяется возрастом культуры, а также количеством и качеством питательной среды.

III — лог-фаза, или логарифмическая (экспоненциальная) фаза, отличается максимальной скоростью размножения клеток и увеличением численности бактериальной популяции в геометрической

прогрессии. Логарифмическая фаза у бактерий с коротким временем генерации продолжается несколько часов.

IV — фаза отрицательного ускорена характеризуется меньшей активностью бактериальных клеток и удлинением периода генерации. Это происходит в результате истощения питательной среды, накопления в ней продуктов метаболизма и дефицита кислорода. Максимальная стационарная фаза характеризуется

равновесием между количеством погибших, вновь образующихся и находящихся в состоянии покоя клеток. Графически максимальная стационарная фаза изображается в виде прямой линии, параллельной

оси абсцисс. При этом количество живых бактерий в популяции обозначают как их максимальную (М) концентрацию в единице объема питательной среды. Данный признак является достаточно стабильным

для определенного вида бактерий в стандартных условиях.

VI — фаза логарифмической гибели бактерий происходит в постоянной скоростью и сменяется VII—VIII фазами уменьшения скорости отмирания клеток.

В непрерывных процессах биообъект постоянно поддерживается в экс­поненциальной фазе роста. Обеспечивается непрерывный приток свежей пита­тельной среды в биореактор и отток из него культуральной жидкости, содержа­щей клетки и продукты их жизнедеятельности. Фундаментальным принципом непрерывных процессов служит равновесие между приростом биомассы за счет деления клеток и их убылью в результате разбавления свежей средой. Различают хемостатный и турбидостатный режимы не­прерывного культивирования. Непрерывное культивирование В отличие от периодического культивирования в непрерывных процессах питательная среда подается непрерывно, удаление биомассы и продуктов ее жизнедеятельности также осуществляется непрерывно. Установившиеся режимы непрерывного культивирования характеризуются постоянством концентрации микроорганизмов и удельной скорости роста популяции. Непрерывное культивирование проводится в открытой динамической системе, которая может быть как гомогенной, так и гетерогенной. Эта система способна к длительной работе в постоянном установившемся режиме.

Гомогенные системы идеального смешения . В системе идеального смешения микроорганизмы растут в культуральной среде, постоянной по своему составу, и, следовательно, в каждый данный момент времени находятся в одном и том же физиологическом состоянии , т. е. в состоянии установившегося динамического равновесия, которое называют «steady state». По количеству ферментеров(стадий, ступеней) гомогенные системы могут быть одностадийными, двухстадийными и многостадийными.

Основным аппаратом для выращивания непрерывной гомогенной культуры является ферментер идеального смешения с устройством для потока среды и слива культуры, поддерживающим постоянный уровень среды. Питательная среда подается в ферментер обычно с помощью насоса.

Указанные процессы имеют технологические преимущества по сравнению с периодическими, поскольку теоретически их можно осуществлять неограниченно длительное время. На практике

Они обычно прерываются в связи с инфицированием культуры посторонней микрофлорой.

Любой периодический процесс можно перевести в непрерывнопроточный . Непрерывнопроточное

Культивирование открывает возможности для поддержания постоянных условий роста путем создания

Такого состава питательной среды, чтобы только один желаемый фактор лимитировал рост. Если

В таком процессе плотность популяции определяется химическим составом среды(концентрацией

Лимитирующего рост фактора), его называют хемостатным культивированием.

Изменяя концентрацию лимитирующего рост фактора, можно изменять плотность популяции.

Изменяя скорость разбавления, можно получать режимы, обеспечивающие различнуюскорость

Роста популяции. При медленном протоке среды, т. е. при медленном росте, культура испытывает сильную лимитацию, глубокое голодание по данному субстрату. При быстром протоке среды, т. е. при быстром росте, степень голодания слабая, приближающаяся к условиям экспоненциального роста.

Хемостатный способ культивирования в строго контролируемых условиях является основным для

Изучения физиологии, биохимии и вообще всех свойств микробных клеток и культур. (+ см документ в приложение!)