- •Диагностика маститов
- •1) Пробы с димастином и мастидином
- •2) Бромтимоловая проба
- •3) Проба отстаивания
- •Физические методы лечения
- •Патогенетическая терапия
- •Лечение окситоцином
- •Антибиотикотерапия
- •Профилактика маститов
- •1. Определение количества клеток в молоке
- •2. Определение каталазы с помощью всплывания диска
- •3. Определение лизоцима молока
3. Определение лизоцима молока
Из каждой четверти вымени в конце доения в стерильные пробирки надаивают по 5—10 мл молока. На подсушенный МПА рН 7,2 в чашках Петри (по одной на каждую корову) высевают суточную бульонную культуру золотистого стафилококка штамма ВМ. Для этого культуру разводят физиологическим раствором 1 : 10 000, по 0,3—0,4 мл равномерно распределяют на агаре в чашках и оставляют на 30—40 минут на горизонтальной поверхности. В агаре каждой чашки делают 4 луночки диаметром 10 мл (пробочником № 5). В каждую луночку вносят стерильной пипеткой по 0,1 мл (2 капли) молока. Чашки выдерживают при комнатной температуре (18—22°) 18 часов, а затем помещают в термостат на 5—6 часов. Если молоко содержит лизоцим М, то вокруг луночки наблюдается задержка роста стафилококков в виде кольца. По диаметру кольца задержки роста микроба определяют титр лизоцима в молоке. Задержка роста меньше 16 мм — молоко от коровы, больной маститом, 17—24 мм — сомнительное, более 25 мм — от здоровой коровы.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Для выявления и дифференциации основных возбудителей маститов необходимо проводить бактериологическое исследование секрета вымени.
Молоко (секрет) для бактериологического исследования отбирают непосредственно после доения в стерильные флаконы или пробирки с ватными пробками с соблюдением правил асептики. Для этого перед взятием молока (секрета) подмывают вымя и вытирают чистым полотенцем. Соски коровы и руки доярки протирают ватным тампоном, смоченным 70%-ным денатурированным спиртом. Нельзя допускать, чтобы сосок касался края посуды. Пробы отправляют в ветеринарную лабораторию, где их исследуют на:
наличие основных возбудителей мастита (патогенных стафилококков и агалактийного стрептококка);
чувствительность микрофлоры молока (секрета) к антибиотикам.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ'МИКРОФЛОРЫ МОЛОКА К АНТИБИОТИКАМ
Исследуемое молоко с соблюдением стерильных условий разливают по 2 мл в стерильные пробирки. Пробирок должно быть на две больше, чем дисков с антибиотиками.
В одной из пробирок определяют реакцию (рН) молока и добавляют в него 0,1 мл бромтимолблау (раствор бромтимолблау готовят так же, как и для диагностики маститов). В зависимости от рН молока смесь окрашивается от желтого (кислое молоко), салатного, зеленого до синего (щелочное молоко) цвета. Записав результат (цвет смеси), данную пробу исключают из опыта* В оставшиеся пробирки (кроме одной) добавляют по одному диску того или иного антибиотика.
Все пробирки с молоком выдерживают при 37° в течение 18— 20 часов в термостате или автоматически регулируемой водяной бане, после чего во всех пробирках проверяют кислотность молока раствором бромтимолблау.
Если кислотность молока в пробирке без антибиотиков до опыта и после выдерживания в течение 18—20 часов в термостате одинакова, патогенных бактерий в молоке нет. При наличии микрофлоры кислотность молока в пробирке без антибиотиков после выдерживания в термостате увеличивается. В этом случае проверяется кислотность молока в пробирках с антибиотиками.
Если кислотность молока с тем или иным антибиотиком (после выдерживания в термостате) не выше первоначальной (до выдерживания в термостате), значит, бактерии, находящиеся в молоке, высокочувствительны к данному антибиотику. Наоборот, если кислотность молока в пробирках с антибиотиками после выдержива-
ния в термостате увеличивается, из этого следует, что находящиеся в молоке бактерии устойчивы к данному антибиотику, причем чем выше кислотность молока, тем устойчивее микроорганизмы.
ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛОКА (СЕКРЕТА) НА НАЛИЧИЕ ПАТОГЕННЫХ СТАФИЛОКОКОВ И АГАЛАКТИЙНЫХ СТРЕПТОКОККОВ
Доставленные в лабораторию пробы молока (секрета) после смешивания высевают по 0,1 мл на мясопептонный агар, содержащий 5%; отмытых эритроцитов барана (коровы), или на элективные среды: мясопептонный агар, содержащий 7,5% поваренной соли и 5% отмытых эритроцитов барана (коровы) для выделения стафилококков и среду В. М. Карташовой для индикации стрептококков. При отсутствии элективных сред можно использовать только 5%-ный кровяной МПА.
Для получения изолированных колоний 1—2 капли секрета наносят на край пластинки питательной среды в чашке Петри и растирают ее по всей пластинке шпателем (согнутая над пламенем пастеровская пипетка). Засеянные чашки (крышкой вниз) выдерживают при температуре 37° в течение 24 часов. Если на чашках получена однородная по морфологии популяция, для дальнейшего исследования достаточно брать по одной колонии с чашки. Если колонии на чашке различны по форме, размерам, окраске, типу гемолиза, следует брать по одной колонии каждого образца. Отобранные колонии отсевают и подвергают дальнейшему исследованию.
Исследование на наличие стафилококков
Большие и средние колонии белого, кремового и лимонно-желтого цвета, образующие хорошо выраженную зону гемолиза эритроцитов на кровяном агаре или на кровяно-солевом агаре, отсевают в пробирки, содержащие 3 мл мясопептонного бульона (лучше предварительно подогретый в термостате) и выращивают при температуре 37° в течение 3—3'/2 часов до помутнения.
Выросшие молодые бульонные культуры микроскопируют, окрашивая по Граму. При обнаружении стафилококков определяют их патогенные свойства реакцией плазмокоагуляции, лизоцимную, дезоксирибонуклеазную (ДНК-азной) активность и отношение к манниту, из которых реакции плазмокоагуляции и гемолиза строго обязательны.
Пропись кровяно-солевого агара
Готовый (стерилизованный в автоклаве) МПА, содержащий 7,5 % хлористого натрия, растапливают и охлаждают до 45°. Прибавляют 5% отмытых эритроцитов барана или крупного рогатого скота, перемешивают, избегая образования пены, и разливают в чашки Петри. Среду можно хранить в холодильнике в течение нескольких дней.
Реакция плазмокоагуляции
Кровь, взятую из сердца кролика, выливают в пробирку со стерильным раствором лимоннокислого натрия и центрифугируют. Полученную плазму разводят стерильным физиологическим раствором в соотношении 1 : 4 и разливают в агглютинационные пробирки по 0,5 мл. 12—18-часовую бульонную культуру испытуемого стафилококка вносят по 2 капли в пробирки с разведенной плазмой. Для контроля в одну пробирку с плазмой не вносят культуры, а в другую засевают заведомо илазмокоагулирующий стафилококк. Пробирки помещают в термостат при 37° и через каждый час в течение 3 часов учитывают результаты. При положительной реакции образовавшийся сгусток не ныпадает из пробирки даже при переворачивании или плавает в плазме.
Указанный метод определения патогенпостн стафилококков основной. При необходимости можно пользоваться и другими тестами.
Определение л и з о ц и м н о й а к т и в и о с т v стафилококков
В качестве тест-культуры используют взвесь живой или убитой 15-минутным кипячением культуры Micrococcus lysodeicticus. Преимущество использования убитой культуры в том, что в этом случае можно пользоваться стандартным препаратом (взвесь убитых микробов можно хранить в холодильнике в течение месяца и более).
В пробирки с 15 мл растопленного и охлажденного до 50J 0,7%-ного агара, приготовленного на переваре Хотингера, вносят взвесь убитой культуры микрококка из расчета 1 млрд. микробных клеток на 1 мл среды (по оптическому стандарту). При использовании живой культуры на 1 мл среды добавляют 100 млн. микробных тел. Содержимое пробирок выливают в чашки Петри и на поверхность застывшего и подсушенного агара бляшками (размазанная петлей капля) наносят 3—4-часовые бульонные культуры испытуемых штаммов стафилококков. На одной чашке можно испытать 7—8 штаммов.
После инкубации посевов в течение суток при 37° вокруг бляшек с ростом культур, продуцирующих лизоцим, появляются зоны лизиса, которые значительно увеличиваются после дополнительного пребывания посевов при комнатной температуре в течение 48 часов.
Определение дезоксирибонуклеазной (ДНК-азной) активности стафилококков
К 150 мл расплавленного стерильного готового 2%-ного МПА (рН 8,6) добавляют 300 мг дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), то есть 2 мг/мл, предварительно растворенной в 15 мл подщелоченной 3 каплями 10%-ного раствора едкого натрия дистил-
лированной воды. После перемешивания среду прогревают в течение ]/2 часа в кипящей бане. К немного остывшей среде добавляют 1,2 мл 10%-ного стерильного хлористого кальция, разливают в чашки, подсушивают и засевают бульонными культурами (штрихами). После 18-часовой инкубации при 37° поверхность чашки заливают 7 мл IN HC1, выдерживают 15 минут, сливают кислоту и учитывают результаты. Появление зон просветления (деполимеризация ДНК) вокруг культур указывает на положительную ДНК-азную реакцию.
Определение отношения к манниту
3—4 капли испытуемой бульонной культуры стафилококка засевают на пробирку среды с 0,5% маннита. В качестве такой среды можно использовать полужидкий агар с индикатором ВР (готовые, сухие среды) или жидкую среду с индикатором Андредэ. Изменение цвета индикатора после 24-часового инкубирования в термостате указывает на ферментацию маннита.
ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛОКА (СЕКРЕТА) НА НАЛИЧИЕ ПАТОГЕННЫХ СТРЕПТОКОККОВ
При учете роста колоний на чашках Петри с кровяным или сывороточным агарами (второй день исследования) отсевают ро-синчатые, мелкие однотипные колонии, характерные для роста стрептококков, на элективную питательную среду для стрептококков (среда В. М. Карташовой), которая готовится следующим образом: к 500 мл МПБ с рН 7,2—7,3 добавляют 2,5 г лактозы, 1 мл спиртового или водного раствора 1 : 100 бромкрезолпурпура (1 г порошка растворяют в 50 мл спирта и добавляют 50 мл дистиллированной воды). Затем МПБ ставят в водяную баню, доводят до кипения и кипятят 5—7 минут. После остывания до -50—55° в колбу добавляют 50 мл стерильной сыворотки без консерванта и 0,5 мл раствора неомицина, в котором содержится 55 000 ЕД антибиотика (500 000 ЕД неомицина растворяют в 10 мл •физиологического раствора). В стерильных условиях среду разливают по 5 мл в пробирки. Цвет ее сине-фиолетовый. Посевы инкубируют в течение 24 часов при 37°.
Изменение сине-фиолетового цвета среды в лимонный или желто-зеленый указывает на рост стрептококков. Из пробирок с измененным цветом среды готовят мазки и окрашивают по Граму. При наличии стрептококков проводится их дальнейшая дифференциация с помощью КАМП-теста.
Постановка КАМП-теста. Суточную культуру бета-гемолитического стафилококка высевают на агар с 5%| крови крупного рогатого скота или барана. Посев делают петлей сплошной линией по диаметру чашки. Перпендикулярно к линии посева стафилококка, не доходя 5—6 мм, высевают ровным штрихом испытуемую культуру стрептококков. На одной чашке можно проверить 8—
10 культур. Чашки помещают в термостат на 24 часа при 37", КАМП-тест считается положительным, если четко выражен гемолиз испытуемого стрептококка в виде усеченного треугольника или полукруга в зоне бета-гемолитического стафилококка.
Положительный КАМП-тест дают только агалактийные стрептококки. На этих же чашках кровяного агара учитывают и тип гемолиза стрептококков. Светлая зона вокруг штриха культуры стрептококков указывает на бета-гемолиз, зеленая зона — на альфа-гемолиз (зеленящие стрептококки).
Для дифференциации непатогенных стрептококков (группа D—фекальные стрептококки и группа N—молочнокислые стрептококки) делают высевы на бульон с 6,5% хлористого натра, на бульон с 40% желчи крупного рогатого скота и на стерильное обезжиренное молоко с добавлением метиленовой сини 1 : 1000 (на 5 мл молока—0,5 мл 1%-ного раствора метиленовой сини). Посевы инкубируют в термостате при 37° и на другой день проводят учет по следующей схеме:
Серологический тип |
Наименование стрептококка |
Гемолиз |
КАМП-тест |
Среда Карташовой |
МПБ с 6,5% NaCl |
МПБ С 40% желчи |
Молоко с метиленовой синью 1:1000 |
МПБ с 0,5% сорбита | |
d |
β | ||||||||
А |
Str. pyogenes |
― |
+ |
― |
+ |
― |
― |
― |
― |
В |
Str. agalactiae |
± |
± |
+ |
+ |
― |
± |
― |
― |
С |
Str. dysgalactiae |
+ |
― |
― |
+ |
― |
― |
― |
± |
Е |
Str. überis |
― |
+ |
― |
+ |
― |
± |
― |
+ |
D |
Str. faecalis |
― |
± |
― |
+ |
+ |
+ |
+ |
± |
N |
Str. lactis |
± |
― |
― |
― |
― |
+ |
± |
― |
N |
Str. cremoris |
± |
― |
― |
― |
― |
― |
+ |
― |