Определение продуцирования стафилококками фермента днк-азы.

С этой целью применяют следующие компоненты:

• щелочной МПА (pH8,4-8,6);

• раствор натриевой соли ДНК (в стерильной дистиллированной воде – 20 мг на 1 мл воды) с добавлением нескольких капель 2%-ного NaOH(можно хранить при 4°С до 40 сут);

• хлорид кальция (раствор, используемый для инъекций);

• 1 н. раствор соляной кислоты.

Методика определения следующая: к расплавленному и несколько охлажденному МПА добавляют раствор натриевой соли ДНК из расчета 1-1,5 мг/мл и стерилизуют в водяной бане кипячением 30-40 минут. После охлаждения среды до 50-60°С к ней асептично добавляют хлорид кальция из расчета 0,8 мг/мл, разливают в чашки Петри по 10-15 мл. На поверхность застывшей среды после её подсушивания в термостате высеивают прикосновением петли в заранее размеченные точки 8-10 испытуемых культур стафилококка и инкубируют 18-20 ч при температуре 37°С. Затем в чашку вносят 4-5 мл 1н. раствора соляной кислоты, которую через 2-3 минуты сливают.

Результат реакции учитывают, просматривая чашки на проходящем рассеянном свете. По наличию просвечивающих зон вокруг колоний на непрозрачном, мутном серо-белом фоне всего слоя агара делают вывод – культура стафилококка продуцирует ДНК-азу.

Сущность пробы заключается в том, что высокополимерная ДНК под воздействием соляной кислоты выпадает в нежный серо-белый осадок (преципитат). Если микроб выделяет фермент ДНК-азу, то в зоне его действия ДНК деполимеризуется и под влиянием соляной кислоты преципитат не образуется, агар в этой зоне остается прозрачным. Патогенные штаммы стафилококка обладают ДНК-азной активностью, вокруг колоний образуется зона просветления – деполимеризация ДНК.

Биологическая проба

Для выявления патогенности стафилококков применяют и биологическую пробу на лабораторных животных (кролики, котята). Патогенность стафилококков обусловлена продуцируемым экзотоксином различной токсической функции. В лабораторной практике чаще определяют летальный токсин и некротоксин. Летальный токсин выявляют внутри венным введением кролику 0,75 мл на 1 кг массы фильтрата бульонной культуры. Наступает острое отравление и гибель через несколько минут. Некротоксин, содержащийся в фильтрате бульонной культуры, определяют также биопробой: кролику выбривают участок кожи и дезинфицируют, внутрикожно вводят 0,2 мл культуры (2 млрд. микробных тел в 1 мл). Через 24 ч появляется некротическая реакция (зона некроза развивается в течение 1-2 дней).

В отдельных случаях (при отравлениях) проверяют наличие стафилококкового энтеротоксина. С этой целью биологическую пробу осуществляют на котятах пероральным введением (с молоком) исследуемой культуры стафилококка.

Для определения вирулентности стафилококков существуют несколько различных методов заражения белых мышей.

Наиболее простым является введение 0,1 мл суточной бульонной культуры испытуемого стафилококка в хвостовую вену. Учет гибели животных осуществляется в течение 10 суток, регистрируют наличие абсцессов в почках.

Ещё один способ: суточная бульонная культура центрифугируется при 3000 об/мин — 30 мин. Полученный осадок ресуспендируется в половинном объеме декантата и в количестве 0,05 мл вводится 6 мышам позади глазного яблока в окологлазничную клетчатку. Культуру, вызывающую гибель половины и более зараженных мышей в течение 6 дней, считают вирулентной.

При этих методах заражения вирулентной культурой у животных развивается общин септический процесс с преимущественным поражением почек. Основная гибель мышеи происходит на 3—5-й день после заражения.

Другие способы заражения белых мышей (внутрибрюшинный и интраназальный) требуют в десятки раз большей заражающей дозы, максимум гибели мышей приходится на 1—2-е сутки, что характеризует преимущественно токсический компонент процесса.

В то же время ряд исследователей отдают предпочтение более простому технически внутрибрюшинному способу заражения мышей, который одновременно позволяет изучать клеточные и гуморальные механизмы развития инфекции.

Сопоставление вирулентности стафилококков для белых мышей с отдельными факторами их патогенности показало, что вирулентность штаммов, по данным большого числа исследователей, коррелирует с уровнем альфа-гемотоксина.