3.Методы диагностики

Диагноз на клебсиеллез ставится на основании эпизоотических данных, клинических признаков, патизменений и результатов лабораторного исследования.

Эпизоотологические данные. Источник возбудителя инфекции — больные животные (телята, поросята) и свиноматки-бактерионосители. Возбудителя выделяли из носовой слизи, при кашле, экссудата из глаз, фекалий.

Заболевание наблюдается в любое время года, но преимущественно в осенне-зимний период во время массовых отелов. Наиболее восприимчив молодняк. Болезнь протекает энзоотически. Во внешнюю среду он выделяется с экскрементами, слизью из носа, молоком. Заражение происходит алиментарно и воздушно-капельным, контактным путем. Телята могут заражаться через молоко. Контаминированное возбудителем молозиво, питьевая вода, подстилка и предметы ухода за животными служат факторами передачи инфекции.

Течение и симптомы болезни. Инкубационный период длится от нескольких часов до 5 дней. Болезнь протекает остро, подостро и хронически.

Заболевают поросята обычно через 8-10 дней после отъема от свиноматок, однако нередки случаи болезни поросят под матками до 20-дневного возраста. Они представляют особую опасность как источник возбудителя инфекции при переводе их на групповое содержание. Преобладающие формы болезни для поросят - респираторная и септическая.

Телята, как правило, заболевают в профилакторный период энтеритной формой. Редко отмечают респираторную форму клебсиеллеза у телят с 20-дневного возраста.

По последним данным, клебсиеллез может развиваться как вторичная инфекция на фоне поражения молодняка вирусами (рота- и корона-), что приводит к более высокой заболеваемости и летальности животных.

При остром течении у телят повышается температура тела до 40°С, развиваются угнетение, анорексия и диарейный синдром. Фекальные массы - зловонные, жидкие, от светло-желтого до серого цвета.

У поросят повышается температура тела до 40,5-41°С. Животные угнетены, дыхание затрудненное, учащенное, болезненное, возникают приступы кашля, напряженность и болезненность брюшной стенки, у некоторых животных появляется рвота и диарея. Поросята стараются принять позу, позволяющую снизить давление на грудную клетку (широко расставляют конечности).

При септической форме развивается еще более выраженные лихорадка и угнетение. Гибель наступает через 2-4сут.

При подостром течении симптомы болезни нарастают медленнее, клинические признаки менее выражены. Подострое и хроническое течение клебсиеллеза как у поросят, так и у телят более характерны при респираторной форме.

Патологоанатомические изменения. У погибших при остром течении болезни видимые слизистые оболочки бледные, цианотичные. Обнаруживают признаки острого катарального энтерита, увеличение лимфоузлов брюшной полости, дистрофию печени. При септической форме отмечают слипчивость кишечника и отек легких с участками катаральной бронхопневмонии. Печень несколько кровенаполнена, селезенка, как правило, увеличена в 2—4 раза, дряблой консистенции.

Лабораторная диагностика клебсиеллеза включает выявление чистой культуры возбудителя болезни и изучение его морфологических и тинкториальных, культуральных, гемолитических, биохимических и патогенных свойств.

Для посмертной бактериологической диагностики клебсиеллеза в лабораторию направляют 2-3 свежих мелких трупа или убитых с диагностической целью больных животных (желательно не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами).

От трупов крупных животных посылают: сердце, перевязанное лигатурой вблизи разреза сосудов, долю печени с желчным пузырем, селезенку, почки, голову (головной мозг), трубчатую кость, брыжеечные лимфатические узлы, регионарные, а также пораженный отрезок тонкого отдела кишечника, перевязанный с двух концов лигатурой. Кишечник вместе с регионарными лимфатическими узлами упаковывают отдельно.

Для прижизненной бактериологической диагностики направляют пробы фекалий . При невозможности доставки проб через 2 часа после взятия их консервируют глицериновым раствором.

Первый день - посевы из патматериала делают на МПБ, среду Эндо и (или) Левина, селективно-дифференциальную среду для выделения клебсиелл с инозитом (КЛЕД-агар). Содержимое тонкого отдела кишечника и фекалии засевают на плотные среды Эндо (или Левина), среду обогащения для клебсиелл К-2. Засеянные чашки и пробирки помещают в термостат (37°С) на 18-24 часа. Для выявления у культур клебсиелл капсулы окраску мазков проводят по методу Гинса (тушью).

Второй день - извлеченные из термостата чашки с культурами на агаре Эндо и (или) Левина, селективно-дифференциальной среде для выделения клебсиелл (КЛЕД-агар) просматривают и отбирают типичные для клебсиелл колонии (5 - выросших после посева фекалий или соскобов со слизистой кишечника и 5 из других органов и тканей, в том числе брыжеечных лимфатических узлов), а затем нумеруют их. Круглые, гладкие колонии с резко возвышающихся над поверхностью агара, диаметром 1,5 – 3,0 мм, красного и розового цвета с металлическим блеском или без него, на селективно-дифференциальной среде (с инозитом) для выделения клебсиелл колонии этого микроорганизма крупные сли­зистые, бледно- или ярко-желтые, диаметром 4-5 мм.

Из отобраных колоний готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Клебсиеллы в мазках выглядят в виде мелких грамотрицательных палочек с закругленными концами, длинной 0,6-6,0 и 0,3-1,5 мкм шириной, расположенных одиночно, попарно или короткими цепочками.

Культуры, полученные в МПБ, в среде обогащения для клебсиелл К-2, пересевают на агар Эндо (или Левина), КЛЕД-агар в чашках Петри, которые помещают в термостат (37-38 °С) на 18-24 часа. Пересев из МПБ проводят в том случае, если отсутствует рост колоний на этих средах в первичных посевах из соответствующих органов и тканей.

Во всех случаях засеянные чашки и пробирки помещают в термостат (37⁰ С) на 16-20 часов.

Третий день — полученные на (КЛЕД-агаре), на агаре Эндо и (или) Левина культуры (после пересева с МПБ или среды обогащения для клебсиелл К-2), окрашивают по Граму, и микроскопируют. При условии чистой культуры пересевают на скошенный МПА для дальнейшего изучения по биохимическим тестам с целью родовой и видовой идентификации.

Четвертый день. Со скошенного МПА культуру засевают на среды Гисса с глюкозой, лактозой, сахарозой, дульцитом, маннитом, среду с мочевиной, агар Симмонса, среду с сернокислым железом Клиглера (тест на сероводород), бульон Хоттингера или МПБ (тест на индол), мясопептонную желатину и ПЖА (подвижность). Для изучения гемолитических свойств 5-6 колоний засевают на чашку с кровяным агаром, разделенную на соответствующее количество секторов.

Для изучения патогенных свойств культур в биопробе проводится посев в 2 пробирки со скошенным МПА.

Засеянные пробирки инкубируют при 37°С течение 48 часов, ежедневно учитывая изменения в средах.

Пятый день - проводят предварительный учет результатов изучения ферментативных свойств культур и определяют на наличие гемолиза. Бактерии рода Klebsiella ферментируют с образованием кислоты и газа глюкозу, маннит, лактозу (за исключением отдельных штаммов), не растут на агаре Симонса, не расщепляют мочевину (кроме К. rhinoscleromatis), не выделяют индол (кроме К. oxytoca) и не образуют сероводород.

Культуры, отклоняющиеся по отдельным ферментативным свойствам от бактерий рода Escherichia, подвергают дополнительному изучению в соответствии с тестами и дифференциальной схемой, изложенными в "Методических указаниях по бактериологической диагностике ассоциированной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями".

Для биопробы используют две культуры на скошенном МПА. Каждую культуру смывают стерильным физ. раствором, готовят суспензии концентрации 1 млрд. микробных клеток/см³ по оптическому стандарту, затем смешивают их в равном объеме и вводят внутрибрюшинном по 0,5 см³ трем белым мышам массой 14-16 г или трем цыплятам 2, 3-х недельного возраста (при исследовании материала от птиц). Наблюдение за зараженными мышами проводят в течение трех суток.

Шестой день - проводят окончательный учет результатов изучения ферментативных свойств культур, предварительный учет результатов биопробы.

Седьмой день - проводят предварительный учет результатов биопробы.

Восьмой день — окончательный учет результатов определения патогенных свойств культур клебсиелл в биопробе на мышах. Культуры, вызывающие гибель двух и более мышей и выделении из их органов культуры клкбсиелл считают патогенными.

Лабораторный диагноз на клебсиеллез считается установленным в каждом из следующих случаев:

- выделения чистых культур клебсиелл не менее чем из двух таких органов и тканей как: селезенки, крови сердца, костного мозга, головного мозга свежего трупа или убитого клинически больного животного без определения их патогенности для белых мышей;

• выделения из патологического материала культур клебсиелл, обладающих патогенностью для белых мышей;

Срок бактериологического исследования до 7 суток.

Первичная идентификация эитеробактерий по биохимическим реакциям в комбинированной среде и выбор тестов для установления родовой принадлежности

Реакция в среде Олькеницкого или Клиглера				Предполагаемые энтеробактерии	Тесты и субстраты для установления рода
Лактоза и/или сахароза	Глюкоза	H2S	Мочевина**
-	КГ	+	-	Виды Salmonella, Citrobacter, Edwardsiella	Индол, сорбит, лизин декарбоксилаза, пробы с поливалентными сыворотками к сальмонеллам
+	К	-	-	Е.coli, виды Citrobacter или не энтеробактерии	Цитрат Симмонса, мочевина (по Преусу или), восстановление нитратов, тест на цитохром оксидазу
+	КГ	-	-	Е.coli, виды Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia	Цитрат Симмонса, подвижность, индол, реакция Фогеса-Проскауера, проба с метиловым красным, лизин декарбоксилаза, орнитин декарбоксилаза, мочевина (по Преусу или Кристенсену)
+	КГ	+	-	Виды Citrobacter, Proteus, Yersinia	Тесты для идентификации видов; фенилаланин дезаминаза
-	К	-	-	Виды Shigеlla, некоторые серовары сальмонелл	Подвижность (при 37 оС и 22 оС), индол, натрия ацетат, фенилаланин дезаминаза, лизин декарбоксилаза, мочевина (по Преусу или Кристенсену), реакция Фогеса-Проскауера и проба с метиловым красным (при 22оС), серологические пробы с антисыворотками к сальмонеллам
-	КГ	+	-	Salmonella, виды Shigella flexneri, Providencia stuartii, виды Serratia	Подвижность (при 37 оС и 22 оС), индол, ацетат Na, фенилаланин дезаминаза, лизин декарбоксилаза, реакция Фогеса-Проскауера и проба с метиловым красным (при 22оС), пробы с поливалентными сальмонеллёзным и дизентерийным фагами, серологические пробы с поливалентными сыворотками к сальмонеллам
-	К	+	-	S. typhi и некоторые другие серовары сальмонелл	Проба с поливалентными сыворотками к сальмонеллам (для идентификации сероваров)
-	-	-	-	Не энтеробактерии	Тесты для идентификации видов; фенилаланин дезаминаза
+	-	-	-	Не энтеробактерии	Тесты для идентификации видов; фенилаланин дезаминаза

Примечание. * - сведения по роду не включены, так как при обычном (37 ^оС) культивировании посевов на твёрдых средах указанные энтеробактерии не растут или дают замедленный скудный рост.

**- при использовании среды Олькеницкого; при выращивании на среде Клиглера проводят параллельный посев в среду с мочевиной (по Преусу или Кристенсену).

К - ферментация глюкозы до кислоты без газообразования; КГ - ферментация глюкозы с образованием газа

Дифференциальные признаки энтеробактерий по биохимическим свойствам

№ п/п

Тесты

РОДЫ И ВИДЫ БАКТЕРИЙ

Escheri- сihia coli

Citrobacter

Enterobacter

Klebsiella pneumo- niae

Salmonella

Proteus

Morganella morganii

Yersinia enterocolitica (tо 22-25оC)

freundii

diversus

aerogenes

cloacae

vulgaris

мiгаbilis

мухоfaciens

Основные

1.

Глюкоза

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

2.

Лактоза

(±)

(±)

(±)

(±)

(±)

+

-

-

-

-

-

-

3.

Сахароза

±

±

±

+

±

+

-

+

±

+

-

+

4.

Маннит

+

+

+

+

+

+

+

-

-

-

-

+

5.

Мальтоза

±

+

+

+

+

+

+

+

-

+

-

+

6.

Рост на агаре Симонса

-

+

+

+

+

+

(±)

±

+

±

-

-

7.

Образование индола

±

-

+

-

-

±

-

+

-

-

+

±

8.

Образование сероводорода

-

+

-

-

-

-

(±)

+

+

-

-

-

9.

Расщепление мочевины

-

±

+

-

+

+

-

+

+

+

+

+

10.

Разжижение желатины

-

-

-

±

-(+)

-

-

+

+

+

-

-

11.

Дезаминирование фенилаланина

-

-

-

-

-

-

-

+

+

+

+

-

Дополнительные

1.

Реакция с метилротом

+

+

+

-

-

±

+

+

+

+

+

-

2.

Реакция Фогес-Проскауэра

-

-

-

+

+

±

-

-

±

+

-

+

3.

Подвижность

±

(±)

(±)

+

+

-

(±)

+

+

+

(±)

+

Обозначения:

«+» - ферментация сахара, образование индола, расщепление мочевины и т.д.

«(+)»- замедленное разжижение желатины

«-» - отсутствие ферментации сахара, образования индола, расщепления мочевины и т.д.

«±» - различные показатели

«(-)» - отдельные штаммы не вызывают ферментации сахара, образования индола и т.д.

Схема бактериологического исследования патологического материала на ассоциированную кишечную инфекцию

Скарификат слизистой, содержимое тонкого отдела кишечника, фекалии (разведение 1:10 – 1:20)

Органы и ткани

Микроскопия культур (окраска по Граму)

Отбор колоний, пересев

МПА

Агар Минка

Возбудители ассоциированной инфекции

Среды для изучения ферментативных свойств культур, скошенный МПА

Изучение культур согласно методическим указаниям по лабораторной диагностике сальмонеллезов животных, обнаружению сальмонелл в кормах и объектах внешней среды

Агар Эндо или Левина

МПБ

Агар Плоскирева, висмут-сульфитный агар

Среда обогащения

Агар Эндо или Левина, агар Плоскирева, висмут-сульфитный агар

Отбор колоний,пересев

Скошенный МПА

Микроскопия культур (окраска по Граму)

Изучение культур согласно методическим указаниям по лабораторной диагностике клебсиеллеза сельскохозяйственных животных

Изучение культур согласно методическим указаниям по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных

Биопроба на белых мышах

Отрицательная Положит