Биологический метод.
Также для выделения возбудителя из материала заражают лаб. животных. Для этого из материала готовят суспензию на стерильном физиологическом растворе в соотношении 1:5-1:10, которую вводят не менее 3-м белым мышам или одному кролику, которым суспензию вводят подкожно в дозе соответственно 0,3 мл и 0,5 мл.
Кролики за несколько дней до заражения должны быть проверены на пастереллоносительство методом провокации. Для этого в каждый носовой ход ежедневно три дня вводят 0,2-0,5%-й водный раствор бриллиантгрюна в дозе 0,2 мл. У животных пастереллоносителей через 18-24 после введения раствора появляется гнойного характера ринит. Кроликов носителей не используют.
2-Й ДЕНЬ
Просматривают посевы:
В положительном случае в жидких средах в первые 18-24 часов выращивания P. multocida дает легкое равномерное помутнение сред. На 2-4 день на дне пробирки образуется характерный слизистый осадок, поднимающийся при встряхивании пробирки в виде не разбивающейся косички с просветлением бульона.
На плотных средах образуются прозрачные, росинчатые колонии с ровными краями, диаметром 2-3 мм, позднее колонии становятся серо-белого цвета. Первичный рост может быть также в виде тонкого налета на поверхности среды. По внешнему виду различают три основных типа колоний: (М-форма) - слизистые, они более крупные, (S-форма) – гладкие, выпуклые, слегка опалесцирующех серовато-белые блестящие колоний с ровными краями и шероховатые (R-форма). Вирулентные штаммы пастерелл, выделенные их трупов животных и птиц, павших при остром течении болезни, чаще всего S и М форм. R-формы- у таких штаммов вирулентность понижена, иногда они авирулентны.
М. haemolytica на кровяном МПА образует слегка выпуклые, просвечивавшиеся, влажные, блестящие, колонии окруженные четкой зоной гемолиза.
Из изолированных колоний делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют с целью изучения (морфологических, тинкториальных свойств и чистоты культуры). Возбудитель имеет вид мелких, грамотрицательных, овоидных палочек.
Дальнейшую идентификацию чистой культуры проводят по биохимическим свойствам, с целью определения родовой и видовой принадлежности.
Бактериологический метод.
Для этого делают пересев чистой культуры на среды Гисса с сахарами и многоатомными спиртами (для определения сахаролитической активности); агар Симмонса (для определения усвоения цитратоаммонийных солей); агар Клиглера ( для определения образования сероводорода); среда с мочевиной (определение уреазной активности); МПБ ( определение образование индола – реакция Легаля –Вейля или бум. пропитанная щавелевой к); МПА (определение и постановки биопробы), ПЖА – для определения подвижности. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37±10 С течение 7-10 дней. Учет результатов производят ежедневно.
3- 4Й ДЕНЬ
Просматриваем посевы:
Р. multocida неподвижна, ферментирует глюкозу, сахарозу, маннозу и маннит с образованием кислоты без газа, не ферментирует рафинозу, лактозу и мальтозу, образует сероводород и индол, не расщепляет мочевину, не растет на среде Симмонса.
P. haemolytica неподвижна, ферментирует глюкозу, сахарозу, лактозу, мальтозу, рафинозу и маннит, не ферментирует маннозу, не все штаммы образуют сероводород, не образует индол, не расщепляет мочевину и образует гемолиз на кровяном агаре.