13.Векторные сис-мы,применяемы для клонир-я в кл-х прокариот-х орг-в.

Векторы – это небольшие молекулы ДНК, способные переносить, размножать и хранить генетическую информацию. При обычном попадании рекомбинантной ДНК в микробную клетку происходит ее разложение внутриклеточными нуклеазами.

Векторные молекулы ДНК после введения в клетку способны к автономному существованию, как самостоятельные мини-хромосомы и при последующих делениях клетки реплицируются и стабильно поддерживаются.

Идеальный вектор для молекулярного клонирования должен иметь точку начала репликации (ori). Он должен содержать не менее двух селективных маркеров и иметь только один сайт узнавания для одной рестриктазы. Вектор должен содержать сайты рестрикции, при этом места разрезания и введения другой ДНК не должны влиять на репликацию вектора.

При помощи такого вектора можно умножать (амплифицировать) гены (ДНК). Чтобы ген экспрессировался (получался продукт, синтезированный по информации введенного гена), вектор должен содержать специфические для данной клетки промоторы и терминаторы («стоп»-кодоны) транскрипции. Вектор должен содержать минимальное количество собственной ДНК, необходимой для его функционирования.

В качестве векторов используют небольшие по размерам молекулы ДНК плазмид, вирусов, бактериофагов.

Наиболее часто в качестве векторов используют плазмиды, выделенные из бактерий. Они представляют собой двуцепочечные кольцевые молекулы ДНК с вериабельными молекулярными массами.

14.Типы векторов:плазмидные и фаговые, космиды и фазмиды.

Используемые плазмидные векторы поддерживаются в клетке в количестве 25—50 копий, но, но их количество может колебаться от одной до более ста. В целом, чем крупнее плазмида, тем меньше количество ее копий в клетке. Первый плазмидный вектор был выделен из E.coli.Наряду с Е. coli, плазмидные векторы получены от Bacillus subtilis и Saccharomycescerevisiae и других микроорганизмов.

Плазмиды стафилококков несут гены устойчивости к пенициллину, соединениям ртути и др. Гены устойчивости к тяжелым металлам обнаружены также в составе R-плазмид Е. coli, у разных видов Е. coli, Salmonella, Saccharomyces обнаружены Col-плазмиды, обеспечивающие синтез высокоспецифичных антибиотиков.

Наиболее емкими по возможности включения чужеродной ДНК являются космидные векторы.Они созданы на основе совмещения в одном геноме плазмидного гена репликатора и cos-сайта фага лямбда. Фаговые и космидные векторы с включенными в них генами, если последние упакованы в инфекционной фаговой частице, можно вводить в бактериальную клетку путем естественного проникновения фага в клетку. Внесение чужой ДНК в клетку при помощи фага называется трансдукцией. Векторные плазмиды и векторные вирусы со встроенными чужеродными генами часто называют гибридными или химерными. Космиды являются гибридными векторами, состоящими из плазмидной ДНК и фрагментов ДНК фага λ. Плазмидная составляющая содержит уникальные сайты рестрикции и селективные маркеры, а фаговая – соединенные липкие концы (cos-сайт). Фазмиды, также как и космиды, являются гибридами плазмид и фага, однако в отличие от космид, в них сохранены функции репликации как плазмиды, так и фага. Фазмиды представляют собой линейные молекулы ДНК, на концах которой находятся сегменты ДНК фага λ.Фазмиды в одних условиях могут размножаться как плазмиды, а в других – как фаги. Размножение фазмиды как фага, заканчивается лизисом клеток и выходом фаговых частиц из клетки.