Раздел V Воспроизведение потомства
Под ред. доктора Гранта С. Фрейзера
Глава 5.1
Цитологическое исследование эндометрия
ДЖОН ДЖ. ДАСКАНИО
Блэксберг, Виргиния
Цитологическое исследование эндометрия является важным методом тщательного исследования половых путей кобылы. При подозрении на заболевание, связанное с воспроизведением потомства, всегда проводится цитологическое исследование с получением маточных культур. Посев маточных культур может показать лишь наличие заражающего микроорганизма. Цитологическое исследование эндометрия во многих случаях показывает одновременное наличие воспалительной реакции, подтверждающей присутствие активной инфекции. Иногда цитология пробы эндометрия не помогает в постановке диагноза или дает ложноотрицательный результат. Такие ошибки бывают результатом неправильного взятия проб или их получения в начале заболевания.
Для исследования маточной среды берутся пробы жидкости/клеток многочисленными методами и с помощью тампонов. Используемый метод, в зависимости от заболевания, оказывает влияние на результаты. Например, локализованную раннюю маточную инфекцию легче обнаружить при исследовании клеток из маточного смыва, чем в мазке из матки. По имеющимся данным, исследование клеток маточного смыва является более диагностическим у кобылы с недостаточностью воспроизводительной функции, чем мазок маточной культуры. Будучи удобным методом, особенно в амбулаторной практике, цитологическое исследование часто проводится по одному маточному мазку. Если в ходе исследования проводится промывание матки, полученная жидкость может быть использована для подтверждения результатов мазка.
Но, независимо от используемого метода, кобылу необходимо сдерживать, ее хвост сворачивают и связывают, чтобы он не мешал при манипуляции, и очищают промежность. Это производится в стерильных перчатках с использованием стерильной мази. Расположение стерильного презерватива или еще одной перчатки над мазком культуры или тюбингом для лаважа помогает предупредить случайное загрязнение матки из клитора, вульвы или влагалища. При введении трубки/тампона во влагалище ветеринар старается избежать контакта с клитором во избежание заражения половых путей.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МАТОЧНОГО ТАМПОНА ДЛЯ ПОСЕВА
В настоящее время выпускается несколько видов маточных тампонов для посева. Два наиболее распространенных из них – это тампоны McCullough (Barber Veterinary Supply, Ричмонд, Вирджиния.) или Kalayjian (Barber Veterinary Supply). Оба вида тампонов имеют предохранительное приспособление на одном конце, а тампон McCullough имеет второй внутренний рукав, который окружает culturette. Тампон McCullough снабжен перфорированным пластмассовым колпачком на конце. При стерильном размещении конца наружного рукава на уровне внутреннего отверстия в цервикальный канал внутренний рукав вводят через перфорационное отверстие в матку. Тампон для взятия культуры затем продвигают через внутренний рукав до тех пор, пока он не достигнет эндометрия. Тампон остается в соприкосновении с эндометрием в течение 10-15 секунд для абсорбирования маточных выделений. Чтобы получить клетки для цитологического исследования, тампон с альгинатом кальция поворачивают на 360 градусов. При трении маточным тампоном о поверхность эндометрия число эритроцитов в пробе возрастает, и при гистероскопии будет виден покрасневший участок. Нужно соблюдать осторожность и не поворачивать тампон по часовой стрелке и против нее, поскольку при этом ослабляются волокна альгината кальция на конце тампона. После удаления тампона из матки конец его осторожно переворачивают на стерильное предметное стекло, а затем помещают в резервуар для хранения и транспортируют в лабораторию для выявления бактерий. Несколько капель стерильного физиологического раствора, помещенные непосредственно на кончик тампона для взятия культуры перед взятием пробы, помогают сохранить цитологическую форму и предоставляют для рассмотрения лучшие пробы; однако, нужно соблюдать осторожность, чтобы не испачкать тампон. Недостатком тампона McCullough является то, что для него требуются стерильные микроскопические стекла, так что один тампон можно использовать как для цитологического исследования, так и для посева на культуры. Можно также использовать два тампона – один для цитологии и один для посева, но при этом увеличивается ятрогенное заражение матки.
Маточный тампон Kalayjian снабжен сменным колпачком, прикрепленным к одной стороне наружного рукава. При размещении колпачка тампона на уровне внутреннего отверстия в цервикальном канале тампон для посева проталкивается через наружный рукав, в результате чего колпачок удаляется с конца рукава. Тампон выдвигается вперед и берется проба, как и с помощью тампона McCullough. После того как тампон оттягивается и убирается обратно в наружный рукав, весь рукав вместе с колпачком продвигается дальше в матку и поворачивается на 360 градусов, чтобы колпачок осторожно сделал соскоб с эндометрия. После этого ветеринар рукой вытягивает рукав обратно во влагалище, накрывая колпачок, как только он выйдет из наружного отверстия канала шейки матки, чтобы клетки влагалища не попали в пробу. После этого колпачок отсекают от наружного рукава и приклеивают к предметному стеклу микроскопа. На первое предметное стекло кладется второе стекло, а за тем их высушивают. Недостатком этого метода является то, что наружный рукав приходится вводить в матку, что увеличивает ее загрязнение, и взятие соскоба колпачком с шейки матки мешает проведению клеточного анализа. Перед введением тампона во влагалище весь тампон для посева можно поместить внутрь стерильного пластмассового презерватива или использовать стерильные перчатки для предохранения наружного колпачка от загрязнения из влагалища. Главным преимуществом этого метода является то, что он позволяет получить хорошие пробы жидкостей/клеток для исследований.
ПРОМЫВАНИЕ МАТКИ
Промывание матки является еще одним методом получения клеточного материала из матки. Стерильная трубка для промывания матки (Jorgensen Laboratory, Loveland, Колорадо) c надувной манжеткой размещается в матке на уровне внутреннего отверстия цервикального канала. В матку вводят около 1 л стерильного физиологического раствора. Ветеринар через прямую кишку осторожно массирует растянутую матку, что увеличивает количество клеток в жидкости для пробы.
При другом методе промывания матки используется инфузионная пипетка (IMV International, Миннеаполис, Миннесота) и присоединенный к ней 60 мл шприц, заполненный стерильным физиологическим раствором. Сразу же после введения физиологического раствора в матку ветеринар оказывает воздействие через прямую кишку, а затем отсасывает из матки как можно больше жидкости. Обычно получают лишь небольшое количество жидкости (около 10 мл).
Жидкость, полученная при данной процедуре, можно использовать двумя путями. Один способ заключается в том, чтобы отправить данную жидкость в диагностическую лабораторию для подготовки/анализа клеточного материала. В лабораториях используется центрифугирование, фильтрация и автоматическая подготовка предметных стекол для получения клеток для анализа. При другом методе применяется разделение соединений по силе тяжести. Полученную жидкость помещают в стерильный ректальный рукав (большой объем) или коническую центрифужную пробирку (малый объем). Жидкость оставляют на месте на 15-20 минут, чтобы клеточный материал осел на дно рукава. Надосадочную жидкость убирают, а концентрированный материл со дна собирают на предметное стекло, высушивают на воздухе и окрашивают.
ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОК
Клетки эндометрия чаще всего окрашиваются по методу Райта, например, Diff-Quik (Fischer Scientific, Norcross, Джорджия). Элементы бактерий и грибков хорошо видны при таком окрашивании. Вначале используются два предметных стекла: одно окрашивается по методу Diff-Quik, а другое оставляют для окрашивания по Граму. Клеточный материал на предметных стеклах как можно быстрее закрепляют для сохранения формы клеток. Клетки выглядят разрушенными, если их своевременно не закрепить. Ядра дегенеративных клеток теряют сферическую форму, приобретают неправильную форму и окрашиваются в розовый цвет из-за уменьшения сродства с основными оттенками. Красители обычно фильтруются (через кофейный фильтр) для удаления остатков и уменьшения артефактов.
Первоначальная оценка предметных стекол производится с использованием объектива малой мощности (40 х) для оценки степени целлюлярности в пробе и в процедуре окрашивания. При наличии лишь нескольких клеток проба будет неточно отражать среду эндометрия, и отбор проб надо повторить. На результаты оказывают влияние остатки присутствующих красителей или над местом окрашивания или под ним. Обычно видны скопления клеток эндометрия, окруженные отдельными клетками. Если проба обладает хорошей популяцией клеток, исследование видов и количества клеток производится с использованием более мощных объективов (400 х сухой, 1000 х масляный).
Количественная оценка числа воспалительных клеток по отношению к клеткам эндометрия может подтвердить наличие воспаления. Для того чтобы считать цитологическую пробу воспалительной, в ней должно быть более 5 воспалительных клеток на 10 участков при использовании объективов высокой мощности (400 х) или более 1-2 воспалительных клеток на 5 участков при использовании объективов высокой мощности (400 х) или соотношение клеток эндометрия к полиморфно-ядерным клеткам должно быть менее 40:1. В пробах с низкой целлюлярностью это соотношение используют с осторожностью, поскольку клеточная популяция не является показателем популяции эндометрия. После того, как ветеринар ознакомится с цитологическими пробами эндометрия, ему легче отличить здоровые пробы от воспалительных без необходимости подсчета всего количества клеток.
Клетки эндометрия могут иметь прямоугольную или колоннообразную форму с реснитчатыми ворсинками на внутренней поверхности эндометрия (рис. 5.1-1). Клетки эндометрия бывают более прямоугольными во время анэструса, а реснитчатые ворсинки присутствуют главным образом во время диэструса. При лечении кобылы простагландинами у нее нарушается естественный клеточный цикл, и больше клеток реснитчатого эпителия становятся заметными во время последующей течки. Иногда реснички отрываются во время обработки клеток на предметных стеклах и вызывают значительные фоновые артефакты. Клетки эндометрия видны поодиночке или в виде скоплений клеток. Высказывалось предположение, что скопления более заметны в период диэструса, а одиночные клетки в период течки, хотя эстральную стадию невозможно определить на основании присутствующего типа клеток. Ядра клеток эндометрия расположены у основания клеток и иногда отделены от своих клеток, возможно, в результате распространения размазывания пробы по предметному стеклу. Свободные ядра, вероятно, являются одним из наиболее распространенных артефактов на предметных стеклах, подготовленных путем размазывания мазков. При дегенерации эндотелиальной клетки ее ядро становится больше и приобретает розовый цвет, так как оно подвергается кариолизу.
Источником прямоугольных клеток может быть цервикальный эпителий. Использование тампонов с двойным предохранительным приспособлением, например, McCullough, снижает вероятность заражения цервикальных клеток. Вагинальные клетки обычно легко определяются как ороговевшие клетки с острыми цитоплазматическими краями, имеющие пикнотические ядра или без них. Слизь из вагинального эпителия также мешает интерпретации цитологических проб, создавая фоновые артефакты.
Наиболее распространенным типом клеток на предметном стекле с цитологией эндометрия (кроме клеток эндометрия) являются нейтрофилы. Они будут видны в многочисленных состояниях ядерной сегментации. Гиперсегментированные нейтрофилы присутствуют во многих хронических процессах. Дегенеративные нейтрофилы имеют ядра, подвергшиеся пикнозу (сморщивание клеточного ядра – прим. перев.) и кариолизу и показывают наличие тяжелого воспаления. Нейтрофилы появляются через 2-5 часов после начала воспаления.
Реже встречаются лимфоциты, клетки плазмы, неактивные и активированные макрофаги, в особенности при хронических заболеваниях. Исключение составляют кобылы после родов, у которых довольно часто обнаруживается большое количество макрофагов, эритроцитов и нейтрофилов. У таких кобыл количество нейтрофилов будет уменьшаться, а число макрофагов увеличится в течение первых 7-9 дней после родов. Эритроцитов меньше, чем нейтрофилов, и центральный участок имеет более светлое окрашивание. Макрофаги часто имеют вакуолизированную цитоплазму и образуют многоядерные гигантские клетки. На 9-й день после родов присутствует очень мало воспалительных клеток, а бактерии отсутствуют. Макрофаги по размерам больше нейтрофилов и имеют необычной формы ядра в виде боба или круга, большое количество светло голубой цитоплазмы, часто с вакуолями и гранулярными остатками.
У кобыл во время цикла лимфоциты считаются в норме, если они наблюдаются редко. Присутствие более значительного числа лимфоцитов говорит о наличии хронического заболевания. Лимфоциты обычно меньше нейтрофилов, но больше эритроцитов. Они имеют тонкий ободок голубой или синей цитоплазмы. Ядро может иметь небольшую вмятину, а в остальном представляет собой круглую структуру. Если первоначальная воспалительная клетка является лимфоцитом, одним из дифференциальных диагнозов является лимфатический стаз.
Роль эозинофилов в полости матки неизвестна. Они могут присутствовать при нарушении или толерантности иммунной системы. Проба считается положительной при обнаружении хотя бы одного эозинофила. Было доказано наличие эозинофилов у кобыл с пневмоматкой и скоплением урины.
Нейтрофилы и макрофаги могут фагоцитировать бактерии и грибки (рис. 5.1-2). Грибы не требуют дальнейшего окрашивания, но второе цитологическое предметное стекло окрашивают красителем Грама для различения грамотрицательных и грамположительных бактерий. Присутствие этих бактерий заставляет ветеринара провести противомикробную терапию до получения результатов посева/чувствительности.
Воспалительные процессы бывают слабыми, умеренными или тяжелыми в зависимости от количества присутствующих клеток и состояния или жизнеспособности этих клеток.
Анализ проб эндометрия лучше всего проводить при острых процессах в активной форме, при которых многочисленные последовательные исследования показывают реакцию матки на лечение. Маточная среда является динамичной, меняющейся средой, и одно цитологическое исследование может не показать направление прогрессирования заболевания. Последним этапом диагностической процедуры является сравнение цитологических данных с результатами посева и данными физического обследования.
Рис. 5.1-1 на с. 227. Колоннообразные реснитчатые клетки эндометрия (увеличение 1000x).
Рис. 5.1-2 на с. 228. Нейтрофилы. Центральный нейтрофил поглотил бактерию Escherichia coli (увеличение 1000x).