Глава 5.19

Уход за донорами эмбрионов и кобылами-реципиентами

ЭДВАРД Л. СКВАЙРЕС

Форт Коллинс, Колорадо

Имеются многочисленные данные о факторах, оказывающих влияние на частоту возникновения беременности после пересадки эмбриона. Несомненно, наиболее важным из этих факторов является уход за кобылой-донором и кобылой-реципиентом. В данной главе главное внимание уделено выбору донора и реципиента и принципам ухода за кобылами, успешно влияющим на пересадку эмбриона.

За последние два десятилетия мало что изменилось в процессе пересадки эмбрионов у лошадей. Пересадка эмбрионов применяется в основном у кобыл старшего возраста, которым не удается зажеребеть естественным путем. Второй наиболее распространенной причиной пересадки эмбрионов является увеличение воспроизведения потомства у кобыл с лучшими генетическими характеристиками, что, таким образом, оказывает большее генетическое влияние на кобыл. Хотя у некоторых пород лошадей в определенные годы рождается небольшое число жеребят, у других пород такие ограничения отсутствуют. Пересадка эмбриона дает кобыле преимущества продолжать участвовать в соревнованиях (скачках, беге по пересеченной местности, выставках), одновременно вынашивая жеребенка. За последние два десятилетия применение пересадки эмбриона в Соединенных Штатах увеличилось незначительно. Техника пересадки эмбриона применяется также и в других странах, например, Аргентине, Бразилии и Австралии.

ВЫБОР КОБЫЛ-ДОНОРОВ И УХОД ЗА НИМИ

При выборе кобылы-донора для пересадки эмбриона лошади важное значение имеют некоторые факторы, в том числе стоимость данной процедуры, данные о репродуктивной системе кобылы, жеребце или используемой сперме, основные указания по учету осеменений, потенциальная ценность жеребят и количество требуемых беременностей. Полное ознакомление с репродуктивной системой конкретной кобылы позволяет специалистам, производящим пересадку эмбриона, определить количество времени, которое потребуется для ожеребения кобылы от кобылы-донора. Кобылы моложе 16 лет с хорошей репродуктивной системой при спаривании с фертильными жеребцами обычно предоставляют эмбрионы в 60 % случаев. В отличие от этого кобылы, страдающие бесплодием, имеют крайне неблагоприятный прогноз на выживание эмбрионов (<30 %). Во многих случаях острый или хронический эндометрит мешает донору зажеребеть или сохранить жеребость. Кроме того, жизнеспособность ооцитов у кобыл старшего возраста (старше 18 лет) значительно уменьшается. Крайне важное значение имеет выбор жеребца или спермы для данного эмбриона. Желательно использовать свежую сперму жеребца, хотя во многих случаях применяется транспортированная охлажденная сперма, фертильность которой не уменьшается при использовании ее в течение 24 часов после сбора. При оплодотворении замороженной спермой пересадка эмбриона во многих случаях вызывает сомнения. Лишь у незначительного числа жеребцов замороженная сперма обладает такой же фертильностью, что и свежая сперма. Поэтому жизнеспособность эмбриона уменьшается при осеменении кобыл замороженной спермой.

Владелец кобылы должен быть в курсе современных направлений по учету осеменений кобыл. Это убережет селекционеров от дорогостоящих ошибок. В некоторых случаях жеребятам, родившимся в результате пересадки эмбриона, отказывали в регистрации породы из-за невозможности получить разрешение на такую пересадку или отсутствии соответствующих данных о группе крови и идентификации по ДНК. Перед тем как заниматься пересадкой эмбрионов, владельцы кобыл должны связаться с вышестоящими организациями по разведению лошадей и ознакомиться с последними требованиями по регистрации жеребят.

Желательно, чтобы перед сбором эмбрионов у каждой кобылы-донора производилось полное обследование репродуктивной системы. Экзамен на пригодность для осеменения включает осмотр наружных половых органов. В некоторых случаях желательно сделать кобыле операцию на половых органах, прежде чем проводить ей пересадку эмбриона. Особое внимание уделяется размерам и тонусу матки, а также размерам, форме и тонусу шейки матки. Также проводится ультразвуковая эхография половых путей для выявления любых признаков патологии, например, маточной жидкости, кисты или воздуха. Шейка матки обследуется через влагалище на наличие спаек, разрывов и других нарушений. Также берутся мазки из матки на посев и цитологическое исследование. Проводится биопсийное исследование тела или рогов матки. Если данные исследования показывают наличие маточной инфекции, сразу же начинается лечение. Обычно первоначальное ультразвуковое исследование проводят на 2-й или 3-й день течки, чтобы проследить за фолликулярными и маточными изменениями. Ежедневное обследование продолжают до наступления овуляции. В период спаривания по возможности ежедневно или через день проводятся случки кобылы-донора с жеребцом. У кобыл в состоянии течки вырабатывается эстроген, о чем свидетельствует наличие складок эндометрия. Количество таких складок измеряется от 0 до 3; 0 означает отсутствие складок, 3 – сильный отек.

Во многих случаях жеребец и кобыла-донор бывают из разных мест. Осеменение кобылы свежей спермой местного жеребца, несомненно, повышает выживаемость эмбриона. При таких условиях время осеменения не имеет столь важного значения, поскольку при необходимости будет получена свежая сперма. Напротив, осеменение кобыл-доноров охлажденной привезенной или замороженной спермой требует, чтобы осеменение и овуляция происходили в одно и то же время. По данным ультразвуковой эхографии, как только у кобылы-донора появляется фолликул размером 35-45 мм, ей можно вводить препарат для стимуляции овуляции, например, hCG (Хорулон) или деслорелин (Овуплант). Выбор препарата для стимуляции овуляции зависит от возраста кобылы и числа предшествующих применений hCG. Многочисленные исследования показывают, что кобылы старшего возраста гораздо реже реагируют на введение hCG, равно как и кобылы, которым в течение данного сезона спаривания были сделаны две или три инъекции hCG. Поэтому для таких кобыл часто применяют деслорелин. Однако если речь идет о первом цикле года, и кобыла-донор молодая или среднего возраста, в этих случаях также можно применять введение hCG. Обычно при получении спермы в течение 24 часов кобыле дают препарат для стимуляции овуляции и на следующий день проводят осеменение.

У многих кобыл-доноров, участвующих в пересадке эмбрионов, после спаривания часто возникает эндометрит. Обследование кобылы-донора проводят в течение 12-24 часов после осеменения. При наличии в матке большого количества жидкости в этом случае для удаления остатков производят промывание матки кобылы-донора стерильным физиологическим раствором или лактированным раствором Рингера. Однако при наличии в матке лишь небольшого количества прозрачной жидкости, в этом случае введение окситоцина помогает удалить жидкость из матки. В некоторых более проблематичных случаях обследование матки производят через 4-6 часов после осеменения и промывают для удаления жидкости из матки. Иногда кобыле вводят антибиотики в течение 3 дней после спаривания для предупреждения повторной инфекции.

При осеменении замороженной спермой для каждого цикла готовят дозы спермы или более, и осеменение кобылы-донора производится следующим образом. Сразу же после появления у кобылы фолликула диаметром 35-45 мм ей вводят человеческий хорионический гонадотропин (hCG) или гонадотропный рилизинг-гормон (GnRH), согласно приведенным выше признакам. Через 24 и 40 часов после введения hCG или GnRH производится осеменение кобылы дозой спермы. При наличии лишь одной дозы замороженной спермы на цикл кобыле ежедневно проводят ультразвуковую эхографию до тех пор, пока не пройдет 24 часа с момента введения hCG. С этого времени ее обследование проводят четыре раза в день (через каждые 6 часов) и сразу же после обнаружения овуляции проводят осеменение одной дозой спермы. Жизнеспособность эмбриона определяют у кобыл на 7-й или 8-й день после овуляции. В течение нескольких последних лет жизнеспособность эмбрионов в лаборатории автора данной статьи устанавливалась через 8 дней после овуляции. У кобыл старшего возраста созревание эмбрионов бывает замедленным, и поэтому вероятность обнаружения эмбриона лучше на 8-й день, чем на 7-й.

ВЫБОР КОБЫЛ-РЕЦИПИЕНТОВ И УХОД ЗА НИМИ

Выбор кобыл-реципиентов и уход за ними с целью пересадки эмбриона является наиболее важным фактором воздействия на частоту возникновения беременностей. В питомниках, где имеется лишь один или два донора, кобыл-реципиентов можно приобрести у местных производителей, имеющих информацию о состоянии половых путей данной кобылы. Однако при приобретении большого количества кобыл-реципиентов их покупают в местных конюшнях, и поэтому перенесенные заболевания половых путей этих кобыл неизвестны. В любом случае кобыла-реципиент должна удовлетворять следующим критериям: вес от 900 до 1200 фунтов (от 450 до 540 кг), возраст от 3 до 10 лет, объезженная или приученная к узде. Влияние размеров кобылы-реципиента на размеры будущего жеребенка не было исследовано. Однако кобыла-донор должна по своим размерам как можно больше соответствовать кобыле-реципиенту. Это может оказаться трудной задачей при получении эмбрионов от больших теплокровных или запрягаемых лошадей.

Обычно легче использовать для пересадки эмбриона некормящих кобыл. Кроме того, животных начинают использовать в качестве реципиентов лишь с наступлением второго цикла после выжеребки, и для этого подходят очень многие кобылы, например, кобылы с нормальным циклом и неповрежденными яичниками, кобылы с удаленными яичниками, кобылы в анэструсе и кобылы во время переходного периода. Автор данной статьи предпочитает использовать кобыл с нормальным циклом и здоровыми яичниками. Тем не менее, было доказано, что частота возникновения беременности у кобыл с удаленными яичниками, на прогестеронной терапии такая же, что и у кобыл со здоровыми яичниками.

Иногда в начале года бывает мало кобыл с нормальным циклом. В данном случае в это время года можно использовать либо кобылу в период анэструса, либо в состоянии перехода. По опыту автора, кобылы в состоянии перехода больше подходят для этого, чем кобылы в анэструсе. Кобыл в состоянии перехода выбирают на основании наличия складок эндометрия, которые свидетельствуют о выделении эстрогена. Затем кобыл в состоянии перехода в период овуляции у кобыл-доноров сажают на прогестеронную терапию. При лечении прогестинными препаратами кобыл с удаленными яичниками и кобыл в состоянии перехода применяют альтреногест (Регумат) ежедневно или по 150 мг прогестерона в день в виде инъекций. При использовании кобыл с удаленными яичниками им продолжают вводить прогестерон до тех пор, пока его не начнет вырабатывать плацента, т.е. примерно через 100-120 дней. У кобыл в состоянии перехода введение прогестерона заканчивается сразу же после наступления овуляции и созревания дополнительных желтых тел на ранних месяцах жеребости.

Перед покупкой кобылу-реципиента обследуют путем ректальной пальпации и ультразвуковой эхографии. Проводится обследование формы наружных половых органов. Кобылы с плохим состоянием наружных половых органов, предрасполагающих к накоплению воздуха, обычно не подходят для пересадки эмбриона. Затем путем пальпации через прямую кишку определяют размеры и тонус матки, шейки матки и яичников. После этого проводится ультразвуковая эхография матки и яичников. Наличие патологии, например, жидкости в матке, маточной кисты, аномалии яичников или наличие воздуха или остатков в матке делают кобылу непригодной для покупки в качестве реципиента эмбриона. Кроме того, не подлежат покупке жеребые кобылы, за исключением тех случаев, когда срок жеребости менее 30 дней.

Приблизительно 15-20 % кобыл, представленных в качестве реципиентов, оказываются неподходящими. Кобылы, прошедшие первоначальное обследование, подвергаются экзамену на пригодность к осеменению аналогично экзамену кобылы-донора. Реципиентам проводится вакцинация против гриппа, столбняка и ринопневмонита, и держат их отдельно от других кобыл по крайней мере в течение 30 дней. Из числа отобранных кобыл худых кормят пищей, обогащенной питательными веществами, и дают достаточное количество сена люцерны. Большинство кобыл-реципиентов покупают поздней осенью и, начиная с 1 декабря, освещают помещение, где они находятся в течение 16 часов. Начиная примерно с 1 февраля, кобылам проводится пальпация и ультразвуковое исследование два раза в неделю до тех пор, пока один из фолликулов не достигнет 35 мм в диаметре. Кобылам с фолликулами более 30 мм ежедневно проводится ультразвуковое исследование до наступления овуляции. Желательно, чтобы у кобыл-реципиентов прошли по крайней мере один или два нормальных эстральных цикла, прежде чем они будут использованы в качестве реципиентов. Кобылы с систематическими нерегулярными или патологическими эстральными циклами исключаются из числа потенциальных пациентов. Введение гормонов кобыле-реципиенту во время эстрального цикла является важной частью пересадки эмбриона. Количество вводимых гормонов зависит от масштабности операции по пересадке эмбриона. Небольшие операции с одним или двумя донорами требуют большего количества гормонов, чем масштабные операции с большим количеством доноров и реципиентов. При небольших операциях донору и одному или двум реципиентам вводят прогестерон в течение 8-10 дней, а затем в последний день лечения применяют простагландины. Прогестерон может применяться либо как альтреногест ежедневно, либо в виде инъекций по 150 мг в день в течение того же промежутка времени. Нередко применяется сочетание прогестерона и эстрогена (150 мг прогестерона, 10 мг эстрадиола-17β) ежедневно в течение 8-10 дней, после чего назначаются простагландины.

У доноров и реципиентов овуляция наступает через 7-10 дней после лечения простагландинами. Обычно желательно, чтобы у реципиента овуляция наступала или за один день до, или примерно через три дня после овуляции у донора. Это достигается путем стимуляции овуляции при помощи hCG (Хорулон) или GnRH (Овуплант) у донора или у реципиента для обеспечения оптимальной синхронности овуляции. На больших селекционных станциях по пересадке эмбрионов частое воздействие на цикл проводится только простагландинами, hCG или GnRH. Обычно записываются даты овуляции у реципиента, и как только у кобылы-донора наступает овуляция, выбирают реципиента с овуляцией либо за один день до, либо примерно через три дня после овуляции у донора. Если кобыла не используется в качестве реципиента, ей дают простагландины в течение 9-10 дней после овуляции и снова вызывают у нее течку.

Перед тем как использовать кобыл в качестве реципиентов, каждой из них проводят окончательное обследование через 5 дней после наступления овуляции. В зависимости от этой проверки на пятый день кобыл делят на подходящих, маргинальных и неподходящих. В ходе проверки на пятый лень проводится пальпация через прямую кишку для определения тонуса матки и шейки матки и ультразвуковая эхография матки и яичников. У кобыл, подходящих для роли реципиента, матка бывает твердой и имеет круглую трубчатую форму, шейка матки при этом закрыта. У нее также должны отсутствовать складки эндометрия, матка имеет нормальные размеры и видно желтое тело. Для кобыл из маргинальной группы характерно понижение тонуса матки или шейки матки или возможно наличие складок эндометрия первой степени. У неподходящих реципиентов обычно слабый маточный тонус, шейка матки размягчена и раскрыта или имеются складки эндометрия и/или жидкость в матке. Ретроспективное исследование, проведенное автором данной статьи, по пересадке эмбриона на коммерческой основе показало, что проверка на пятый день лучше всего показывает возможность жеребости у кобылы-реципиента.

Пересадка эмбрионов производится либо хирургическим путем при помощи бокового разреза, либо нехирургическим путем. Многие селекционные станции по пересадке эмбрионов в настоящее время используют нехирургические методы пересадки. Более подробно методы пересадки эмбрионов будут рассмотрены в следующей главе. Через 4-5 дней после пересадки у кобыл производится ультразвуковое исследование на наличие жеребости. Кобыл с подтвержденной жеребостью повторно обследуют на 16, 25, 35 дни. Кобылы с неподтвержденной беременностью при первоначальном обследовании (на 12 день) проходят повторное обследование через два дня. Но если результаты ультразвукового исследования продолжают показывать отсутствие жеребости, кобылу считают нежеребой и дают ей простагландин для стимуляции течки. За исключением тех случаев, когда размеры эмбриона крайне малы (менее 150 микронов), на 12 день жеребости у большинства кобыл заметна везикула. Кобылы, у которых везикула не появляется до 14-16 дней жеребости, развитие эмбриона замедлено, и эмбрион с большей вероятностью может погибнуть на ранней стадии жеребости. Первоначальное ультразвуковое исследование позволяет селекционеру решить, нужно ли проводить повторное спаривание донора и делать усилия для выживания второго эмбриона. Ультразвуковое исследование на 25 день показывает наличие зародыша с нормальным сердцебиением. Чаще всего потеря эмбриона при его пересадке реципиенту происходит между 12 и 35 днями. Однако ранняя потеря эмбриона на сроке жеребости менее 50 дней при пересадке эмбрионов реципиентам случается не чаще, чем у других жеребых кобыл, осемененных либо свежей, либо охлажденной спермой. Кобыл, которые не жеребеют после пересадки эмбриона, обычно используют для второй попытки, но третья попытка не предпринимается. Частота возникновения жеребостей у кобыл при пересадке эмбриона во время второй попытки не отличается от тех, которые зажеребели с первой попытки.

Жеребые реципиенты в первые две триместра беременности получают поддерживающее питание, аналогично другим племенным кобылам, после чего в последнюю треть жеребости им дают концентрированный прикорм для получения дополнительной энергии. Перед приближающимися родами за реципиентами устанавливается тщательное наблюдение. Уход за ними аналогичен тому, что и за жеребыми племенными кобылами. Выжеребка у реципиентов с пересадкой эмбриона вызывает не больше затруднений, чем у обычных племенных кобыл. Влияние на выжеребку размеров реципиента и донора полностью не изучено, но у лошадей такое влияние не столь важно, как у домашнего скота.

Подводя итоги, можно сказать, что при пересадке эмбрионов и надлежащем уходе за кобылой-донором и кобылой-реципиентом можно добиться довольно большой частоты возникновения жеребости. Следует уделять внимание выбору донора и реципиента, питанию, проводить необходимое наблюдение за ними путем пальпации через прямую кишку и ультразвукового исследования, проводить тщательную оценку состояния реципиента и обеспечивать должный уход за ним после пересадки эмбриона. На 12-й день частота возникновения жеребости после осеменения свежей или охлажденной спермой составляет 75-80 %, а при 50-дневном сроке жеребости – 65-70 %.