Глава 5.18
Искусственное осеменение кобыл привезенной спермой
ЭЛИЗАБЕТ МЕТКАЛФ
Шервуд, Орегон
Поскольку многие организации, занимающиеся разведением лошадей, разрешают и даже поощряют искусственное осеменение (AI) привезенной спермой, новые технологии развивающейся промышленности стараются удовлетворить потребности владельцев лошадей и селекционеров. Продолжается усовершенствование технологий транспортировки спермы и усложняется обучение персонала, занимающегося применением привезенной спермы. К тому же методы оценки фертильности кобыл и жеребцов также становятся более точными и потому представляют большие возможности для выбора подходящих кандидатов для осеменения.
Искусственное осеменение, как охлажденной, так и замороженной спермой, имеет много преимуществ перед естественным спариванием. Оно позволяет владельцам кобыл оплодотворять свою кобылу спермой любого жеребца независимо от расстояния, в особенности спермой, сохраненной при низкой температуре. Сокращение расходов на транспортировку и содержание кобыл позволяет использовать жеребцов из-за границы, благодаря чему обеспечивается генетическая изменчивость и гибридная сила. Сперму определенного качества можно привезти задолго до осеменения. Кроме того, при искусственном осеменении уменьшается вероятность распространения инфекционных заболеваний, как венерических, так и системных, а также повреждений кобыл и жеребцов.
ВЫБОР ЖЕРЕБЦА
Часто по просьбе клиентов ветеринары соглашаются производить осеменение кобылы до получения какой-либо информации о жеребце и его сперме. Результаты бывают удачными или по крайней мере предсказуемыми, если данный ветеринар принимает участие в выборе жеребца. Сначала владелец кобылы выбирает для нее нескольких возможных жеребцов-кандидатов. После этого ветеринар кобылы проводит беседу с селекционером и/или ветеринаром жеребца относительно ранней и настоящей фертильности спермы данного жеребца, ее доступности и дозировки, конкретного расписания и способа отправки спермы и ответственного лица, с которым можно будет связаться при готовности кобылы к осеменению. Из этой первоначальной беседы можно получить многочисленные данные относительно фертильности жеребца и наблюдения за ним.
Оценка фертильности спермы жеребца производится с помощью многочисленных анализов. Наиболее информативным из них является частота выжеребки кобыл. Несмотря на то, что ни один из лабораторных анализов in vitro не представляет точных данных о фертильности жеребца, было доказано, что жеребцы с большим количеством морфологически здоровых сперматозоидов с прогрессирующей подвижностью, которая мало уменьшается в течение первых 24 часов хранения, часто обладают лучшей фертильностью, чем те, у которых данные качества отсутствуют. Фертильность жеребца также определяется такими исследованиями in vitro, как флуоцитометрический анализ оболочек сперматозоида, органелл и ДНК, автоматизированный анализ подвижности сперматозоидов, фильтрация с помощью стекловаты или гранул сефадекса, анализ на связывание и проникновение и анализ на наличие антител к антисперме. К сожалению, из-за больших затрат сперма большинства жеребцов редко подвергается такому тщательному исследованию.
Некоторыми поводами для беспокойства относительно выбора жеребца могут быть следующие:
1. Владелец жеребца сообщает о том, что у его жеребца обильное количество спермы в каждом эякуляте (но концентрация сперматозоидов неизвестна), и ее центрифугирование не проводилось
2. Заявления, что порции эякулята будет достаточно для ожеребения кобылы (один эякулят здорового жеребца содержит достаточное количество сперматозоидов для оплодотворения более чем одной кобылы)
3. Заявление, что нет необходимости подсчитывать концентрацию сперматозоидов при каждом сборе спермы перед разбавлением ее для отправки или о том, что сперму НУЖНО отправить в тот же день самолетом для сохранения ее подвижности и/или фертильности
С другой стороны, некоторые порядочные и добросовестные владельцы жеребцов сообщают практикующему ветеринару, что после нескольких лет проведения оценки данных по жеребости кобыл от определенного жеребца в дозе осеменения может содержаться меньшее число подвижных сперматозоидов, чем ожидалось. Часто такие владельцы в курсе, что для осеменения одной кобылы и получения оптимальных результатов беременности требуется незначительное количество спермы одного сильно востребованного жеребца. Поэтому не стоит отвергать осеменение кобылы спермой такого породистого жеребца.
ПОДГОТОВКА КОБЫЛЫ К ИСКУССТВЕННОМУ ОСЕМЕНЕНИЮ
Конечной целью осеменения является предоставление спермы в такой период времени, когда наличие фертильных сперматозоидов сочетается с выходом ооцита в фаллопиеву трубу кобылы. Ветеринар также должен следить за обеспечением оптимального состояния матки, в которой будет происходить развитие эмбриона. Поэтому подготовку кобылы начинают задолго до ожидаемой даты осеменения.
Слишком часто фертильность кобылы не принимается во внимание, и ее выбирают просто как племенную кобылу. На самом же деле ее потенциальная фертильность подлежит столь же тщательной оценке, как и фертильность жеребца. В начале сезона спаривания необходимо проводить обследование кобыл на фертильность (BSE) на основании их возраста и способности к деторождению. BSE может заключать в себе как данные ректального и ультразвукового исследований половых путей, так и исследования на цитологию, посев и/или биопсию эндометрия и видеоэндоскопического исследования эндометрия. Проведение каждого ректального обследования под контролем УЗИ предоставляет ветеринару дополнительную информацию и позволяет обнаружить многочисленные изменения, недоступные пальпации, что увеличивает вероятность возникновения беременности.
У молодых нерожавших кобыл, особенно у тех, которые никогда не участвовали в соревнованиях, проведения ректального и ультразвукового исследований до осеменения достаточно. По мнению автора данной статьи, у жеребой кобылы необходимо проводить цитологическое исследование эндометрия. Такой анализ является несложным методом, который проводится прямо в стойле и позволяет сразу же получить информацию о состоянии слизистой оболочки эндометрия. Если в мазке присутствует значительное количество полиморфно-ядерных лейкоцитов (PMN), значит, кобыла страдает эндометритом, и необходимо определить его этиологию перед началом осеменения. Цитологический анализ также позволяет обнаружить бактерии и дрожжи.
Во время эстральной фазы периода течки обычно проводится ректальная пальпация половых путей под контролем ультразвукового исследования, которая выявляет главный растущий фолликул, помимо классического рисунка «колеса со спицами» отека эндометрия, которые подлежат количественной оценке. Ультразвуковое исследование также показывает наличие эхогенных частиц внутри фолликула, а также увеличение эхогенности его стенки, что является показателем овуляции, которая произойдет в течение последующих 24 часов. Хотя продолжительность течки у кобыл бывает различной, у многих кобыл овуляция наступает ближе к концу данной эстральной фазы. Как ни странно, перед овуляцией при ультразвуковом исследовании отек менее заметен. Поскольку время осеменения по отношению к овуляции имеет столь важное значение, контролируя время овуляции по наличию или отсутствию такого отека, можно оптимизировать частоту возникновения беременности. Более подробно данный вопрос рассмотрен в главах 5.7 и 5.14.
Были исследованы некоторые факторы, сокращающие промежуток перед овуляцией у кобыл. Наиболее эффективными факторами являются активность лютеинизирующего гормона (ЛГ) и различная степень активности фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Человеческий хорионический гонадотропин (hCG) с мощной ЛГ активностью в настоящее время является наименее дорогим и, возможно, наиболее популярным препаратом для стимуляции овуляции. По имеющимся данным, его эффективная дозировка составляет от 1000 до 5000 МЕ при внутримышечном, внутривенном или подкожном введении. Автор данной статьи обычно рассчитывает дозу в зависимости от размеров кобылы; большим кобылам требуются большие дозы, а таким породам, как миниатюрная лошадь, или небольшим пони требуется минимальная доза hCG.
Использование hCG у кобыл вызывает некоторые сомнения. Во-первых, в нескольких исследованиях при повторном употреблении было установлено выработка антител; однако, многие практикующие ветеринары не согласны с результатами данного исследования. Во-вторых, некоторые владельцы кобыл часто жалуются, что их кобылы испытывают боль после введения некоторых препаратов hCG. И наконец, вызывает сомнения надежность hCG в ускорении овуляции, в особенности у кобыл старшего возраста или кобыл, находящихся в группе риска. Но, несмотря на возможные недостатки, hCG часто применяется в качестве недорогого эффективного средства для стимуляции овуляции у большинства кобыл.
Было доказано, что аналоги синтетического гонадотропного рилизинг-гормона (GnRH) (деслорелин ацетат и бусерелин) оказывают эффективное воздействие на стимуляцию овуляции. Хотя использование этих последних препаратов слегка замедляет наступление последующей течки у кобылы в случае, если беременность не наступает, по опыту автора данной статьи, такие аналоги GnRH более надежны для стимуляции овуляции, в особенности у кобыл с проблемами овуляции. В эту группу входят кобылы старшего возраста, кобылы с весенним переходом и кобылы с сопутствующим лечением препаратами, подавляющими простагландины, что характерно для многих противовоспалительных препаратов.
Препараты для стимуляции овуляции гораздо более надежны и эффективны при их применении в соответствующий период течки. Если при ультразвуковом исследовании заметны складки эндометрия и имеется размягчение главного фолликула (обычно диаметром более 30 мм), применение hCG, деслорелин ацетата и бусерелина скорее всего ускорят наступление овуляции в среднем на 36, 41-48 и 24-48 часов соответственно после введения стимулирующего препарата. Сэмпер (см. список литературы) сообщал, что у 98 % кобыл с максимальным отеком эндометрия после применения hCG или деслорелина овуляция чаще всего наступала в пределах 48 часов после применения препарата.
ИСКУССТВЕННОЕ ОСЕМЕНЕНИЕ
При естественном спаривании пенис жеребца проникает в расслабленную шейку матки кобылы и после эякуляции сперма попадает в матку. Эякулят представляет собой сильные «выбросы» семенной жидкости или импульсы, которые сразу же достигают дистальных рогов матки или сосочков фаллопиевых труб. При ритмичных движениях пениса жеребца происходит массаж влагалища кобылы, что стимулирует сокращение матки и дальнейшее проникновение спермы в фаллопиевы трубы. Обычно налитый кровью пенис жеребца препятствует вытеканию спермы из влагалища сразу же после эякуляции.
Для подражания естественному спариванию и в то же время для ограничения заражения половых путей кобылы рекомендуются следующие процедуры. Кобылу сдерживают соответствующим образом имеющимися поручными средствами для защиты животновода, проводящего осеменение. Другие приспособления, эффективно используемые для сдерживания кобыл, обычно оказываются ненужными. При использовании химических сдерживающих средств применение α2-агонистов, таких, как ксилазин, предпочтительнее, чем других препаратов, поскольку они оказывают влияние на сократительную способность матки кобылы в тот период, когда она находится под действием эстрогена, в особенности у кобыл с замедленным очищением матки после осеменения.
Хвост кобылы завязывают и убирают так, чтобы он не касался вульвы и промежности. Вульву хорошо моют жидким мылом и тщательно прополаскивают водой. Такую процедуру повторяют по крайней мере три раза до тех пор, пока данный участок не станет совершенно чистым от каких-либо остатков. Затем область вульвы и промежности протирают чистым бумажным полотенцем.
Животновод, проводящий осеменение, надевает стерильную перчатку и берет стерильную пипетку для осеменения большим пальцем и ладонью, чтобы кончик ее находился в стерильной среде (рис. 5.18-1). При осеменении соломинки с замороженной и оттаявшей спермой емкостью 0,5 мл вместо пипетки можно использовать осеменяющее ружье. Место указательного пальца на перчатке слегка смазывают неспермицидной стерильной мазью. В другую нестерильную руку берут неспермицидный шприц с подготовленной спермой, оберегая его от неблагоприятного воздействия окружающей среды, в частности ультрафиолетового излучения, холода, тепла и попадания воздуха.
Животновод вводит руку в перчатке, продолжая защищать кончик пипетки, через половые губы кобылы (рис. 5.18-2) к своду влагалища и вставляет один или два пальца в цервикальное отверстие. Этот палец (пальцы) затем помогает продвижению пипетки со спермой в шейку матки и приблизительно на 1 см в матку кобылы. Если пипетка не встречает никакого сопротивления в матке, ее можно осторожно слегка продвинуть в требуемый (обычно с той же стороны, что и созревший фолликул) рог матки. Это не всегда возможно из-за отечности и складок эндометрия, поэтому нужно соблюдать повышенную осторожность, чтобы не повредить эндометрий. При введении пипетки в нужное место нажимают на поршень шприца, и сперма попадает в матку. Если при надавливании на поршень ощущается сопротивление, значит, конец пипетки упирается в эндометрий, поэтому нужно сместить пипетку. Сначала в пипетку набирают небольшое количество воздуха для ее прочищения. Массаж свода влагалища при убирании руки стимулирует сокращение матки и способствует продвижению сперматозоидов в маточно-трубное соустье (UTJ).
Рис. 5.18-1 на с. 273: Животновод, проводящий осеменение, осторожно придерживает большим пальцем и ладонью конец стерильной пипетки для искусственного осеменения.
Рис. 5.18-2. Животновод продолжает придерживать пипетку рукой по мере ее проникновения во влагалище кобылы.
УВЕЛИЧЕНИЕ ЧАСТОТЫ БЕРЕМЕННОСТЕЙ ПРИ ПОМОЩИ ИСКУССТВЕННОГО ОСЕМЕНЕНИЯ
Было отмечено, что частота возникновения беременностей при использовании транспортированной охлажденной спермы составляла от 20 до 80 % и более. Несмотря на некоторую зависимость от фертильности кобылы и жеребца, непостоянство результатов часто бывает вызвано другими факторами, которые включают уход и работу с жеребцом, подготовку спермы, ее разведение, отправку, число подвижных сперматозоидов для осеменения, работу с кобылой, подготовку кобылы для осеменения, методику осеменения, контакт со спермой во время осеменения и уход за кобылой после осеменения. Поэтому частота возникновения беременностей зависит от фертильности лошадей и опыта и добросовестности людей, принимающих участие в данной процедуре.
Частота возникновения беременностей при использовании замороженной и оттаявшей спермы также сильно варьируется. Сперма, хранящаяся при низкой температуре, обладает меньшей фертильностью, чем охлажденная сперма, но это может быть следствием, по крайней мере отчасти, интенсивной обработки, которой подвергается замороженная сперма для успешного осеменения. Несмотря на то, что многие исследователи доказали, что частота возникновения беременностей на цикл составляет от 25 до 45 %, при тщательном уходе за кобылами и осеменением до или после овуляции при проведении осеменения через каждые 24 часа или после овуляции была достигнута гораздо более высокая частота беременностей (более 70 % на цикл). Более того, результаты недавнего исследования, проведенного Лумисом (см. список литературы), показывают, что отправка охлажденной или замороженной спермы из его питомника многим владельцам кобыл не оказывала существенного влияния на частоту возникновения беременностей при первом цикле, сезонную частоту беременностей и количество циклов на беременность в зависимости от отправки (таблица 5.18-1). В этом исследовании животноводы должны были осеменять кобыл оттаявшей после заморозки спермой до овуляции, в непосредственной близости к овуляции и после овуляции. В этом случае предоставлялся наилучший выбор жеребцов, и персонал питомников с племенными жеребцами прошел тщательное обучение, а также непосредственно участвовал в выборе и осеменении кобыл.
В последнее время большое значение стали придавать участку введения спермы. Хотя частота возникновения беременностей, по-видимому, не зависит от количества спермы, было доказано, что при введении совсем небольшого количества подвижных сперматозоидов (1 х 106 подвижных сперматозоидов), введенных либо в маточно-трубное соустье, либо в фаллопиеву трубу, заметно увеличивалась частота возникновения беременностей. Кроме того, глубокое осеменение матки также повышает частоту возникновения беременностей. В данном методе, описанном Ригби и его коллегами, пипетку со спермой вводят через шейку матки в тело матки, затем ее направляют в рог матки, расположенный с той же стороны, что и главный фолликул. При помощи трансректальных манипуляций пипетку продвигают в рог, осторожно проникая пипеткой в матку, как это делается у коров. Однако из-за отечности эндометрия кобылы во время течки нужно соблюдать крайнюю осторожность, чтобы не повредить эндометрий при использовании данного метода. Введение дозы спермы при выполнении данной процедуры показано на рис. 5.18-3.
Таблица 5.18-1 на с. 274. Частота возникновения беременностей при использовании охлажденной и замороженной спермы
|
Параметры |
Охлажденная сперма |
Замороженная сперма |
|
Количество жеребцов Количество кобыл Частота беременности при первом цикле Частота сезонной беременности Циклы/беременность |
16 850 59,4 % 74,7 % 2,06 |
106 876 51,3 % 75,6 % 2,08 |
Рис. 5.18-3 на с. 274. Схематичное изображение матки: участки введения спермы при искусственном осеменении. А. Тело матки; В. Рог матки; С. Маточно-трубное соустье у сосочка фаллопиевой трубы. (С любезного разрешения Молли МакАлистер, Портленд, Орегон).
ДОЗИРОВКА ОХЛАЖДЕННОЙ СПЕРМЫ ДЛЯ ИСКУССТВЕННОГО ОСЕМЕНЕНИЯ
Общепринятая минимальная доза осеменения, требуемая для максимальной частоты возникновения беременностей, составляет 500 х 106 сперматозоидов с прогрессирующей подвижностью при осеменении кобыл во время течки через каждые 48 часов до наступления овуляции. Джеско с коллегами (см. список литературы) далее отмечал, что данное количество спермы необходимо развести до концентрации 25-50 х 106 подвижных сперматозоидов на мл для достижения максимальной частоты беременностей. Как отмечалось выше, от жеребцов зависит минимальная доза, а не окончательная концентрация сперматозоидов.
Часто доставляется больше одной дозировки спермы, и в связи с этим возникает вопрос, хранить ли неиспользованную сперму при 4º С или немедленно производить осеменение кобылы. Сторонники «объективной» гипотезы считают, что фаллопиевы трубы кобылы уже заполнены спермой после первого осеменения, и запасы ее не надо пополнять по крайней мере в течение 24 часов. По их мнению, использование кобылы в качестве «хранилища» второй дозы спермы неразумно, поскольку избыток спермы все равно вытечет. Те, которые рассматривают кобылу в качестве оптимального резервуара для спермы, считают, что хотя подвижность второй дозы сперматозоидов отстает от первой, нет необходимости подвергать сомнению фертильность этой дозы и поэтому лучше ввести ее в кобылу.
В исследованиях данных доводов либо проводились эксперименты с малым количеством жеребцов, либо не учитывался интервал между осеменением и овуляцией. Однако Хейсканен с коллегами (см. список литературы) доказали, что у кобыл, осемененных спермой, хранившейся при 5º С в течение 40-80 часов, отмечалась успешная частота беременностей, равная 87 % и 65 % соответственно, что свидетельствует о высокой частоте возникновения беременностей при оплодотворении консервированной спермой. Тем не менее, оптимальные средства для сохранения фертильности «лишней» спермы до сих пор вызывают сомнения, поскольку, как уже отмечалось, у разных жеребцов и кобыл фертильность спермы меняется.
При наличии условно оптимальной дозы спермы она может быть недостаточно разбавленной, количество сперматозоидов может быть низким, и их подвижность или морфология могут быть слабыми. Если общее количество спермы недостаточно велико для того, чтобы она вытекала из шейки матки при осеменении, нужно предпринимать все возможные попытки для осеменения достаточным количеством спермы для получения оптимальной дозы для наступления беременности. При наличии слишком большого количества спермы, можно попытаться провести ее центрифугирование, но подвижность центрифугированной спермы, по мнению автора, была слабой. Таким образом, очевидно, лучше всего проводить повторное осеменение кобылы через 6-12 часов после первого осеменения с использованием второй дозы спермы, чтобы обеспечить ее оптимальным количеством спермы в течение 24 часов.
ДОЗИРОВКА ЗАМОРОЖЕННОЙ СПЕРМЫ ДЛЯ ИСКУССТВЕННОГО ОСЕМЕНЕНИЯ
Как уже отмечалось, количество морфологически здоровых сперматозоидов с прогрессирующей подвижностью, необходимое для оптимальной частоты возникновения беременностей при осеменении замороженной и оттаявшей спермой, зависит от жеребца и ухода за ним. Многие исследователи считают, что для оптимальной дозы осеменения необходимо по крайней мере 200 х 106 прогрессивно подвижных сперматозоидов; некоторые считают нужным проводить осеменение бόльшим количеством. Автор данной статьи предпочитает проводить осеменение по крайней мере 300 х 106 подвижных сперматозоидов, как до, так и после овуляции, всего с 6-8 часовым интервалом между осеменениями (при этом овуляция наступает во время этого промежутка). Хотя физиологический эндометрит, возникающий при реакции на сперму при первом осеменении, наиболее выражен через 6-12 часов после осеменения, данный метод, по-видимому, не оказывает побочного действия на частоту возникновения беременностей.
ВРЕМЯ ОСЕМЕНЕНИЯ
При использовании охлажденной спермы осеменение кобыл производится в течение 24 часов до овуляции, благодаря чему у сперматозоидов имеется достаточно времени для перемещения в фаллопиеву трубу. Успешная частота возникновения беременностей достигалась после осеменения кобыл ранее 48 часов до овуляции, из чего можно предположить, что сперматозоиды могут выживать в фаллопиевых трубах в течение длительного времени. При оплодотворении кобыл охлажденной спермой после наступления овуляции частота возникновения беременностей и жизнеспособность эмбрионов значительно уменьшаются.
При использовании замороженной и оттаявшей спермы осеменение производится непосредственно перед овуляцией, поскольку предполагается, что сперматозоиды в оттаявшей сперме неспособны к столь длительному выживанию в половых путях кобыл. Многие ветеринары и специалисты считают, что легче производить осеменение после овуляции из-за трудности ее предсказания и из-за того, что ценная сперма может пропасть зря, если у кобылы не наступит овуляция в подходящее время после осеменения. Однако количество беременностей на цикл после осеменения вслед за овуляцией обычно не столь высоко, как количество беременностей при осеменении кобыл как до, так и после овуляции. Однако сперма некоторых жеребцов является исключением из этого общего правила. Имеются данные о частом возникновении беременностей на цикл (более 70 %) у кобыл, осеменение которых производилось согласно плану, приведенному в таблице 5.18-2.
В заключение хочется отметить, что люди, работающие в данной отрасли, не в состоянии учесть многочисленные факторы, которые находятся за пределами их контроля в попытке «улучшить» природу. Тем не менее, тщательное добросовестное обращение с запасами спермы позволяет с успехом использовать огромные преимущества искусственного осеменения с применением как свежей, так и замороженной спермы.
Таблица 5.18-2. План проведения осеменения замороженной спермой.
|
День |
Стадия |
Процедура |
|
1-4
5
6
7
8 |
Начало течки
Наличие отека Созревание главного фолликула Максимальный отек Размягчение главного фолликула в 10 часов утра (а) Уменьшение отека Утолщение стенки фолликула (b)Отек отсутствует Размягченный фолликул неправильной формы (с) Отек отсутствует Фолликул «пульсирует» при оказании давления (а) Геморрагическое тело. Отсутствие жидкости в полости матки. (b) Геморрагическое тело. Отсутствие жидкости в полости матки. |
Ежедневное обследование кобылы по утрам. Введение аналога hCGилиGnRH(деслорин)
Обследование в 10 часов утра.
Обследование в 4 часа дня.
Проведение первого осеменения в 22.00.
Проведение второго осеменения в 6 часов утра. Повторное исследование внутриматочной жидкости днем, лечение в случае необходимости. |
hCG – человеческий хорионический гонадотропин.GnRH – гонадотропный рилизинг-гормон.