Глава 5.17

Сохранение спермы при низких температурах

ДЖОН В. СТЕЙНЕР

Лексингтон, Кентукки

За последние 10-15 лет значительно возросло использование замороженной, а затем оттаявшей спермы. Такой вид спермы обладает огромными преимуществами для владельцев как жеребцов, так и кобыл. Генетический материал может храниться сколько угодно времени и использоваться даже после смерти жеребца.

Успешное сохранение спермы жеребцов при низких температурах зависит от сложной серии взаимосвязи разбавителя, криозащитных веществ, степени охлаждения и согревания спермы для уменьшения повреждения в результате холодового шока, образования кристаллов льда и обезвоживания. Поскольку у некоторых жеребцов сперма лучше выдерживает процесс замораживания и оттаивания, степень фертильности спермы у разных жеребцов бывает различной, даже при одинаковых условиях замораживания и оттаивания. Причины такой «зависимости жеребца» неизвестны.

По мнению автора данной статьи, подвижность замороженной спермы жеребца после оттаивания не всегда бывает точным показателем ее фертильности. Иногда сперматозоиды могут проявлять превосходную подвижность, но, тем не менее, они никогда не вызывают беременность, в то время как другие сперматозоиды, применяемые при аналогичных условиях, со слабой подвижностью достигают достаточной частоты оплодотворения. Обычно готовая замороженная сперма должна иметь прогрессирующую подвижность сперматозоидов после оттаивания по крайней мере 25 %.

В данной главе не дается исчерпывающая информация о сохранении спермы жеребцов при низких температурах. В ней автор приводит практическую методику, которая помогла ему добиться успеха.

ОЦЕНКА ЖЕРЕБЦОВ

Перед сбором и замораживанием спермы проводится полное обследование жеребца на предмет здорового осеменения. Для этого производится взятие посева аэробных бактерий из пениса, ладьевидной ямки и мочеиспускательного канала до и после эякуляции. При анализе спермы исследуется ее концентрация, общее количество сперматозоидов, общая подвижность и прогрессирующая подвижность. Кроме того, пробы спермы жеребцов исследуются на наличие вирусного артериита лошадей (EVA) и инфекционной анемии лошадей. При положительной реакции пробы сыворотки на EVA у невакцинированного жеребца проводится дальнейшее исследование спермы, чтобы убедиться, что данный жеребец не является носителем вируса. Одновременно производится замораживание и последующее оттаивание спермы, чтобы оценить, насколько хорошо сперма данного жеребца выдерживает процесс замораживания и оттаивания.

СОЛОМИНКИ ДЛЯ СБОРА СПЕРМЫ

Хотя замороженная сперма выпускается в разных упаковках, наиболее распространенными являются соломинки емкостью 0,5 мл и 5 мл. При системе упаковки по 0,5 мл обычно для осеменения кобылы требуется много соломинок, а в упаковке 5 мл обычно содержится одна доза для осеменения. Автор данной статьи предпочитает макропробирку емкостью 5 мл (Minitube of America, Inc., Верона, Висконсин), и в данной главе рассмотрено ее применение.

Зная среднее количество эякулята и концентрацию спермы у конкретного жеребца, можно приготовить соломинки до начала сбора спермы. Каждую 5 мл соломинку запечатывают с одного конца закупоривающимися шариками, которые могут иметь различный цвет для облегчения идентификации. Шарик нужно поместить в конец соломинки, чтобы в соломинку не мог попасть жидкий азот. Для этого шарик вводят концом 10-мл шприца. На каждой соломинке помещают этикетку, на которой ставят дату замораживания, породу жеребца, его кличку и регистрационный номер, а также фамилию человека или устройства, производившего замораживание спермы. Данные наносятся на этикетку специальным магнитным карандашом или заказывают соломинки с предварительно приклеенными этикетками.

РАЗБАВИТЕЛЬ ЗАМОРОЖЕННОЙ СПЕРМЫ

Автор данной статьи почти всегда использует разбавитель замороженной спермы В4, разработанный доктором Пэт Бернс. Этот разбавитель изготавливают большими партиями, а затем делят на части, кратные 50 мл, которые хранятся для будущего употребления. Для приготовления разбавителя замороженной спермы В4 берут 70 граммов сахарозы и 9 граммов глюкозы и растворяют в 800 мл теплой (45ºС) стерильной воды в лабораторном стакане емкостью 1200 мл. Смесь размешивают магнитной мешалкой в течение 10 минут и добавляют в нее 24 г нежирного сухого молока (Sanalac, Hunt Wesson Inc., Fullerton, Calif.) и 1 г тикарциллина. Затем объем смеси доводят до 1000 мл и помешивают до полного растворения. pH раствора должна быть 6,6-6,8 и осмоляльность 348-360 мОсм. Разбавитель хранится в центрифужных пробирках емкостью 50 мл или в стаканах емкостью 225 г при температуре 20ºС. Перед употреблением его нужно подогреть до 33ºС и хорошо перемешать. Равные неиспользованные доли разбавителя хранятся в морозильной камере.

ПОДГОТОВКА ЭЯКУЛЯТА ДЛЯ СОХРАНЕНИЯ ПРИ НИЗКОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ

Пробу спермы получают при помощи искусственного влагалища с фильтром. В эякуляте оценивают концентрацию сперматозоидов, общее количество сперматозоидов, объем и общую/прогрессирующую подвижность сперматозоидов.

Затем эякулят смешивают с разбавителем на основе снятого молока/глюкозы в соотношении 1:1 (рамочка 5.17-1). Затем производится центрифугирование данной смеси при 400 G при комнатной температуре для концентрации сперматозоидов. Время центрифугирования бывает различно для эякулятов разных жеребцов. Многие эякуляты центрифугируют в течение 10-15 минут для получения гранулированной спермы, которая должна быть достаточно мягкой и не содержать в себе инородных примесей. Необходимое время центрифугирования у конкретных жеребцов устанавливается экспериментальным путем.

РАМОЧКА 5.17-1.

Формула Кеннея для разбавителя спермы
Ингредиент	Количество
Твердые вещества нежирного сухого молока Глюкоза Деионизированная вода Кристаллический пенициллин G* Кристаллический стрептомицин сульфат* 7,5 % NaHCO3	2,4 г 4,9 г 92 мл 150000 МЕ 150000 мкг 2 мл

* 100 г тикарциллина можно заменить на пенициллин и стрептомицин

Во время центрифугирования эякулята готовят охлажденный разбавитель для последующего разведения гранулированной спермы. Окончательное количество (FV) сперматозоидов в охлажденном разбавителе определяется по следующей формуле:

FV = .

Концентрация сперматозоидов в 5 мл соломинке обычно составляет 200-250 х 10⁶/мл. Таким образом, для пробы спермы, содержащей 10 миллиардов сперматозоидов, формула будет выглядеть так:

FV = = 40 мл окончательного объема для замораживания.

Поскольку каждая соломинка содержит 5 мл, в целом из эякулята, содержащего 10 миллиардов сперматозоидов, можно подготовить восемь соломинок (250 х 10⁶ сперматозоидов/мл).

После подсчета окончательного охлажденного объема подсчитывают количество глицерина (криозащитное вещество) и количество яичного желтка, которые нужно добавить в разбавитель В4, по следующим формулам:

Количество яичного желтка = FV х 0,08

Количество глицерина = FV х 0,035

Яичный желток необходимо отделить от белка свежего яйца, смешать с разбавителем Кеннея в соотношении 1:1 и центрифугировать при 10.000 G в течение 15 минут. Надосадочную жидкость (осветленный раствор) сохраняют для использования в процессе разведения.

МЕТОДИКА ЗАМОРАЖИВАНИЯ

Проводится осмотр центрифугированных пробирок и оценка количества гранулированной спермы. Количество охлажденного разбавителя подсчитывают по следующей формуле:

Количество охлажденного разбавителя = FV – (яичный желток + глицерин + предполагаемое количество гранулированной спермы)

Яичный желток и глицерин добавляют в подсчитанный объем охлажденного разбавителя (В4). Не нарушая гранул спермы, из центрифугированной спермы аспирируют надосадочную жидкость и выбрасывают ее.

Подогретый разбавитель В4, содержащий яичный желток и глицерин, добавляют к гранулам, которые повторно суспендируют, слегка помешивая. При помощи гемоцитометра измеряют концентрацию разбавленной (предварительно замороженной) спермы и оценивают подвижность сперматозоидов.

Необходимое количество соломинок с этикетками помещают на полку морозилки. После приготовления разбавленной спермы ее вместе с пустыми соломинками помещают в холодильник (при 5ºС) и охлаждают по крайней мере в течение 30 минут. Затем соломинки заполняют 5 мл подготовленной спермы, и открытый конец запечатывают закупоривающим шариком. Положение спермы в соломинке надо регулировать так, чтобы воздушный пузырек находился в центре каждой соломинки.

Пенопластовый контейнер, предназначенный для размещения в холодильнике, заполняют жидким азотом. Жидкий азот должен помещаться на 1 см ниже положения соломинки на полке морозилки, эту точку предварительно измеряют и отмечают данный уровень в пенопластовом контейнере. Затем полку ставят в пенопластовый контейнер так, чтобы соломинки были на 1 см выше уровня жидкого азота, и оставляют их в парах азота при температуре около –165ºС в течение 15 минут. Затем соломинки погружают в жидкий азот по крайней мере на 10 минут, после чего их можно поместить в стакан и хранить в резервуаре для хранения жидкого азота. При использовании соломинок емкостью 0,5 мл их помещают на полку морозильной камеры приблизительно на 3-5 см выше жидкого азота и оставляют в его испарениях азота по крайней мере на 5 минут перед погружением в жидкий азот.

МЕТОДИКА ОТТАИВАНИЯ

Соломинки емкостью 5 мл оттаивают в течение 45 секунд в высоком (300 см) цилиндрическом контейнере с водой, нагретой до 50ºС. Для этой цели хорошо подходит емкость для хранения макарон. Примерно через 30 секунд содержимое соломинок становится жидким, и воздушные пузырьки поднимаются кверху. Соломинку быстро переворачивают так, что воздух теперь находился внизу и снова медленно поднимался наверх.

Оттаявшую соломинку убирают и тщательно высушивают. Теперь сперма готова для осеменения, и одной соломинки достаточно для одного осеменения. Сперму используют сразу же или помещают в инкубатор на 5-10 минут при 37ºС.

Оттаивание соломинок емкостью 0,5 мл обычно производится в водяной бане при 37ºС в течение 30 секунд. В зависимости от подвижности сперматозоидов после оттаивания и конечной концентрации сперматозоидов в соломинке обычно требуется от 4 до 8 таких соломинок для одного осеменения.

ТРАНСПОРТИРОВКА СПЕРМЫ

Осеменение кобыл замороженной спермой будет рассмотрено в дальнейших разделах данной книги. Общество териогенологии разработано руководящие принципы по вопросам транспортировки замороженной спермы лошадей. Замороженная сперма должна сопровождаться правильно оформленной документацией, в особенности по методике оттаивания спермы, которая вручается реципиенту. Это имеет важное значение для сохранения оптимальной жизнеспособности спермы после оттаивания, поскольку при различных методах замораживания требуются различные методы оттаивания. Принявший замороженную сперму практикующий ветеринар должен правильно сделать об этом запись. Точная документация позволит быстро подготовить соломинки со спермой.

Замороженную сперму перевозят в специально подготовленном сухом грузоподъемнике регулярным воздушным или срочным рейсом. В отличие от баков с жидким азотом, партия спермы в сухом грузовом контейнере не считается опасным грузом.