Глава 5.16
Сохранение спермы жеребцов в жидкостях
ДИКСОН Д. ВАРНЕР
Колледж Стейшн, Техас
В настоящее время некоторые организации по разведению лошадей разрешают использовать транспортированную жидкую сперму. Владельцы кобыл и жеребцов проявляют повышенный интерес к данной технологии благодаря преимуществам, которыми обладает транспортированная сперма для спаривания. К сожалению, не все продуцируемые жеребцами сперматозоиды выживают в процессе охлаждения спермы. Применяемые методы контроля качества позволяют определить способность к выживанию сперматозоидов у каждого жеребца для обеспечения подвижности спермы в тех случаях, когда оплодотворение кобылы производится охлажденной спермой.
Перед началом сезона спаривания производится исследование жеребцов, сперма которых будет транспортироваться в охлажденном виде, и способность самой спермы выдерживать замораживание. Если качество спермы остается удовлетворительным после 24 часов хранения в охлажденном виде, она признаются годной и рекомендуется для транспортировки и осеменения кобыл. Важное значение имеет также и то, что это позволяет оценить общее количество сперматозоидов, которые подвергают обработке для получения нужной дозы осеменения после охлаждения, чтобы повысить частоту возникновения беременностей во время спаривания кобыл.
МЕДИКО-САНИТАРНЫЕ ПРАВИЛА
Правила относительно междуштатной транспортировки спермы четко не определены, поэтому часто упакованная сперма транспортируется по Соединенным Штатам на пассажирских или почтовых самолетах без наличия гигиенических сертификатов. Во избежание противозаконной транспортировки спермы она должна соответствовать постановлениям, принятым в различных штатах. В некоторых штатах разработаны общие требования по гигиеническим сертификатам, в других же нужно специальное разрешение на транспортировку спермы. Поэтому частные лица, намеревающиеся перевозить сперму за пределы данного штата, должны выполнять требования, принятые в том штате, куда направляется сперма. Необходимо связаться с ветеринарами штата для получения информации относительно постановлений, принятых в конкретном штате. Для достижения приемлемой фертильности охлажденная сперма используется для осеменения кобыл в течение 24-48 часов после сбора, поэтому такой вид транспортированной спермы обычно не подходит для международных перевозок.
ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА УСПЕХ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ ТРАНСПОРТИРОВАННОЙ ОХЛАЖДЕННОЙ СПЕРМОЙ
При оплодотворении охлажденной спермой жеребцов на частоту возникновения беременностей влияют многочисленные факторы. Некоторые из них включают количество сперматозоидов, имеющихся для оплодотворения, частоту осеменения, концентрацию сперматозоидов в разбавителе, вид используемого разбавителя (в том числе антибиотики), степень охлаждения разбавленных сперматозоидов, время и температуру хранения перед оплодотворением, различные реакции сперматозоидов на охлаждение и присущую кобылам и жеребцам фертильность. Если качество свежей спермы жеребца неважное или кобыла обладает слабой фертильностью при оплодотворении свежей спермой, едва ли можно добиться успеха при оплодотворении охлажденной транспортированной спермой. Наилучшие результаты получаются при оплодотворении консервированной спермой при проведении исследования низкокачественных эякулятов. Другими факторами, влияющими на фертильность, при использовании данного метода являются метод сбора спермы, время, прошедшее между сбором спермы и ее разбавлением, метод упаковки спермы, интервал между осеменением и овуляцией и метод осеменения. На чувствительность сперматозоидов оказывают влияние многие факторы окружающей среды, в том числе изменения температуры, освещение, физические травмы и различные химические вещества. Поэтому любой фактор, который отрицательно воздействует на способность сперматозоидов оказывать сопротивление поражению, вызванному окружающей средой, пагубно сказывался на фертильности при использовании для оплодотворения охлажденной транспортированной спермы.
Не у всех жеребцов вырабатываются сперматозоиды, выдерживающие охлаждение. Иногда владельцы/директора питомников по разведению жеребцов рекламируют «транспортированную сперму» и подписывают контракты на оплодотворение транспортированной спермой, взятой у жеребцов, сперматозоиды которых плохо переносят процесс охлаждения. Неправильная обработка охлажденной спермы иногда приводит к ухудшению качества транспортируемой спермы, которую тем не менее приходится использовать для оплодотворения кобыл, поскольку другую партию спермы невозможно достать в тот срок, когда необходимо провести спаривание кобылы. В таких случаях частота возникновения беременностей будет условно оптимальной, что приведет к значительному увеличению стоимости спаривания и вызовет недовольство владельцев кобыл. Перед тем, как рекламировать охлажденную транспортированную сперму для осеменения кобыл, нужно провести обследование жеребцов, чтобы установить, сохраняет ли их сперма свои качества после охлаждения.
ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ ПО ИССЛЕДОВАНИЮ СПОСОБНОСТИ СПЕРМАТОЗОИДОВ СОХРАНЯТЬ СВОИ КАЧЕСТВА ПОСЛЕ ОХЛАЖДЕНИЯ
Консервирование спермы начинается с ее сбора, и методика сбора спермы во многом определяет ее качественную оценку. На эякуляцию спермы оказывают влияние условия окружающей среды, поэтому неправильное обращение с пробами спермы до проведения ее анализа может привести к ошибочной интерпретации результатов, таким образом, снижая ее ценность и способность переносить охлаждение.
Сбор спермы производится в специально подготовленное искусственное влагалище, которое должно быть чистым изнутри и не содержать остатков потенциально токсичных веществ, например, мыла или водопроводной воды. После употребления искусственное влагалище тщательно промывают деионизированной водой для удаления загрязнения, затем ополаскивают 70 % изопропиловым или этиловым спиртом для предупреждения роста микроорганизмов и дают высохнуть. Перед сбором спермы искусственное влагалище смазывают веществом, не вредным для сперматозоидов. Кроме того, резервуар для сбора спермы также не должен оказывать вредного воздействия на сперму и иметь фильтр для отделения геля от не содержащей его порции эякулята.
После сбора сперму подвергают тщательной и эффективной обработке. Ее сразу же помещают в светозащитный инкубатор при температуре 37-38º С. Все предметы, находящиеся в соприкосновении с влажной спермой, предварительно нагревают до 37-38º С для предупреждения холодового шока сперматозоидов. Отфильтрованную, не содержащую геля сперму сливают в градуированный цилиндр для точного измерения объема. Некоторые емкости для сбора проб имеют неточную градуировку.
Концентрацию сперматозоидов в не содержащей геля сперме определяют либо с помощью гемоцитометра, либо правильно градуированного фотометрического прибора. Общее количество сперматозоидов в эякуляте подсчитывается путем умножения концентрации сперматозоидов на количество не содержащей геля спермы. Такой расчет необходим (при учете подвижных сперматозоидов) для определения числа осеменений с помощью данного эякулята и определения количества разбавителя спермы, который нужно добавить во влажную сперму для увеличения ее подвижности после хранения в охлажденном виде. Порцию не содержащей геля спермы разводят соответствующим, предварительно подогретым разбавителем, затем выдерживают при 37-38º С в течение 5-10 минут, после чего производится подсчет последовательно подвижных сперматозоидов в данной пробе в процентах.
При измерении подвижности влажной (неразбавленной) спермы могут быть допущены ошибки. Подогретый нежирный разбавитель на основе сухого снятого молока и глюкозы (NFDSM-G) хорошо подходит для данной цели, поскольку он поддерживает подвижность сперматозоидов и не препятствует их микроскопической визуализации. Для стандартизации условий испытания подвижности сперматозоидов все пробы спермы перед анализом разводят разбавителем со специальной концентрацией (например, 25 х 10 сперматозоидов/мл). Желательно проводить оценку подвижности сперматозоидов при увеличении в 200-400 раз с использованием микроскопа, снабженного фазоконтрастным оптическим прибором и предварительным подогревом.
При осеменении консервированной спермой большое значение имеет отсев эякулятов плохого качества. Если свежая сперма жеребца плохого качества, то оплодотворение консервированной спермой скорее всего не даст положительных результатов. Разбавленную сперму фертильных жеребцов часто можно хранить в охлажденном виде в течение нескольких часов или дней до осеменения без значительного уменьшения частоты возникновения беременностей. Жизнеспособность сперматозоидов in vitro можно увеличить путем разведения его высококачественным разбавителем, охлаждением разбавленной спермы и сохранением ее при надлежащей температуре до употребления.
Разбавители спермы содержат защитные ингредиенты, которые обеспечивают жизнеспособность сперматозоидов за пределами половых путей. Липопротеины, например, содержащиеся в молоке, защищают сперматозоиды от холодового шока путем стабилизации клеточных мембран. Метаболизируемые субстраты, например, глюкоза, являются богатым источником энергии для сперматозоидов. В разбавители спермы добавляют антибиотики для замедления или прекращения роста бактерий.
Для максимального выживания сперматозоидов также учитывается осмотическое давление и pH разбавителей. Разбавители готовят самостоятельно или используют готовые формулы. Было установлено, что такие антибиотики, как пенициллина G калиевая соль (1000 ед/мл разбавителя), амикацин сульфат (100-1000 мкг/мл разбавителя), амикацин сульфат в сочетании с пенициллином G или тикарциллин (100-1000 мкг/мл разбавителя) подходят для включения в состав NFDSM разбавителя. Эти антибиотики не нарушают подвижность хранящихся сперматозоидов и подавляют размножение многих бактерий, присутствующих в сперме жеребцов. Сочетание калия пенициллина G с амикацином позволяет лучше бороться с ростом бактерий, чем тикарциллин или любой из антибиотиков, взятый отдельно.
Желательно смешивать сперму с предварительно подогретым (до 37-38º С) разбавителем в течение нескольких минут после эякуляции. При немедленном использовании для осеменения сперму разводят разбавителем в минимальном соотношении 1:1. Если сперма перед осеменением будет храниться дольше 2-4 часов, требуется большее разведение (т.е больше разбавителя по отношению к сперме). Окончательная концентрация, равная 25-50 миллионов сперматозоидов на 1 мл разбавленной спермы обычно максимально увеличивает выживаемость сперматозоидов in vitro. Можно также добавлять разбавитель к сперме в соотношении 1:4 – 1:19 (сперма : разбавитель) для уменьшения количества семенной плазмы в эякуляте до 5-20 % от разбавленного объема. Семенная плазма оказывает вредное воздействие на жизнеспособность сперматозоидов при хранении спермы, если она занимает более 20 % от общего объема разбавленной спермы; однако, сохранение некоторого количества семенной плазмы обычно улучшает подвижность сперматозоидов. Концентрация сперматозоидов в разбавленной сперме должна быть не менее 25 миллионов на 1 мл. Если жеребец эякулирует разбавленную сперму (например, с концентрацией ≤100 миллионов сперматозоидов на 1 мл), при разведении разбавителем до достижения конечной концентрации 25 миллионов сперматозоидов на 1 мл не будет достигнута защита сперматозоидов от влияния окружающей среды, что вызовет малую выживаемость сперматозоидов после хранения в охлажденном состоянии. В таких случаях полезно смешивать влажную сперму с разбавителем, а затем разбавленную сперму центрифугируют при 500 х г в течение 10 минут, аспирируют надосадочную жидкость и повторно суспендируют гранулированную сперму в дополнительном свежем разбавителе. Большая часть семенной плазмы удаляется после центрифугирования и аспирации надосадочной жидкости, поэтому оставшуюся гранулированную сперму повторно суспендируют в разбавителе, чтобы получить конечную концентрацию 25-100 миллионов сперматозоидов на мл. Было доказано, что у некоторых жеребцов центрифугирование разбавленной спермы, а затем повторное суспендирование в свежем разбавителе улучшают подвижность сперматозоидов после 24 часов хранения в охлажденном виде при 5º С.
ТЕХНИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ХРАНЕНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВКИ СПЕРМЫ
Охлаждение и температура хранения влияют на выживаемость сперматозоидов после хранения. Желательно поддерживать температуру от 4º С до 8º С, при сравнительно медленном охлаждении, особенно при температурах ниже 20º С. Недавние исследования показали, что диапазон температур, при которых сперматозоиды наиболее чувствительны к быстрому охлаждению, составляет от 20º С до 5º С. Они быстро охлаждаются от 37º С до 20º С, но требуют медленного постепенного охлаждения в диапазоне от 20º С до 5º С для сохранения максимальной подвижности.
В настоящее время выпускается несколько видов контейнеров, специально предназначенных для медленного охлаждения и транспортировки спермы жеребцов. Появление таких изделий значительно облегчило процесс осеменения «заказанной по почте» спермой и сделало его более успешным для владельцев кобыл. В настоящее время наиболее распространенными контейнерами для транспортировки охлажденной спермы лошадей являются Equitainer I и Equitainer II (Hamilton Research, Inc., Hamilton, Mass.). Выпускаются также менее дорогие одноразовые контейнеры для транспортировки спермы.
Все вышеуказанные контейнеры предназначены для транспортировки спермы с пассивным охлаждением, обеспечивающими различную степень охлаждения (т.е степень охлаждения постепенно замедляется при понижении температуры внутри контейнера). При такой пассивной системе охлаждения степень охлаждения может меняться в зависимости от окружающей температуры и количества разбавленной охлаждаемой спермы. Сравнительное исследование этих контейнеров при потенциально неблагоприятных условиях хранения во время транспортировки по воздуху и по земле показало, что подвижность сперматозоидов в достаточной мере поддерживалась во многих выпускаемых контейнерах для транспортировки спермы жеребцов при умеренной (22º С) и высокой (37º С) окружающей температуре. При низкой окружающей температуре (-20º С в течение 6 часов) подвижность сперматозоидов постепенно уменьшалась в большинстве одноразовых грузовых контейнеров. Поэтому контейнеры Equitainer являются наиболее подходящими для транспортировки замороженной спермы в течение продолжительного времени.
ДОЗА ОСЕМЕНЕНИЯ (КОЛИЧЕСТВО СПЕРМЫ)
Минимальная доза осеменения охлажденной спермой жеребцов, приводящая к частому возникновению беременности, неизвестна. Обычно при искусственном осеменении (AI), когда используется свежая разбавленная сперма, требуется 250-500 миллионов подвижных сперматозоидов. При аккуратном обращении со свежей спермой, взятой у достаточно фертильного жеребца, дозу осеменения иногда можно сократить до 100 миллионов подвижных сперматозоидов без уменьшения фертильности. Поскольку при хранении жизнеспособность сперматозоидов уменьшается, минимальное количество подвижных сперматозоидов для достижения требуемой частоты возникновения беременности по всей вероятности будет выше при использовании охлажденного семени жеребцов.
Наилучшим методом определения необходимой дозы осеменения, требуемой для транспортировки, является проведение испытаний по охлаждению спермы для каждого конкретного жеребца. Сперму разводят соответствующим разбавителем(лями), как описано выше, и охлаждают в течение 24 часов. После этого охлажденную пробу спермы слегка перемешивают, и подогревают до 37º С. Подвижность сперматозоидов оценивают через 10-15 минут после подогревания, и измеряют процентное содержание подвижных сперматозоидов после хранения для того, чтобы будущая партия спермы содержала по крайней мере 500 миллионов подвижных сперматозоидов после 24 часов охлаждения. Например, если после 24 часов охлаждения процентное содержание подвижных сперматозоидов составляет 50 %, общая численность сперматозоидов в партии должна составить 1 миллиард для того, чтобы получить дозу 500 миллионов сперматозоидов, необходимую для осеменения кобылы. Объем спермы для осеменения по-видимому не влияет на фертильность, если в разбавленной сперме содержится по крайней мере от 25 до 50 х 106 сперм./мл.
ДВОЙНОЕ ОСЕМЕНЕНИЕ
Многие владельцы жеребцов и директора питомников подготавливают два пакета (дозы осеменения) с разбавленной спермой для отправки: один для первоначального осеменения после прибытия, а другой для повторного осеменения на следующий день. Во многих случаях, чем дольше сперма хранится в замороженном виде, тем ниже становится подвижность сперматозоидов. Например, в Техасском медицинском ветеринарном центре в одной группе из 19 кобыл проводилось осеменение транспортированной охлажденной спермой, при этом семь кобыл оплодотворяли до и после овуляции спермой, предварительно упакованной в две дозы для осеменения, содержащиеся в одной партии спермы. У сперматозоидов в шести таких партиях при первом осеменении подвижность составляла 40 % и менее, и всего лишь 1-10 % сохраняли подвижность во время второго осеменения через 12-24 часа после первого.
Автор данной статьи считает, что за исключением тех случаев, когда сперма конкретного жеребца сохраняет жизнеспособность в течение 48 часов хранения в охлажденном виде, желательно производить осеменение кобылы всей транспортированной спермой данной партии как можно скорее после ее прибытия, а не затягивать с осеменением и не производить вторичное осеменение через 12-24 часа после доставки спермы. Однако если сперму сохраняют для вторичного осеменения на следующий день, нужно соблюдать меры предосторожности, чтобы сохранять охлажденную сперму при надлежащей температуре до момента вторичного осеменения. Чтобы сократить время и расходы на осеменение кобылы транспортированной охлажденной спермой, ветеринар должен стараться сократить количество партий спермы, требуемых для осеменения.
ДРУГИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
При перевозке охлажденной спермы для осеменения кобылы в другое место партия спермы должна сопровождаться документом, в который включены данные о ее обработке так, чтобы при получении можно было опознать жеребца перед осеменением и узнать о процессе обработки спермы. Копии этого документа также должны храниться в дежурном журнале владельца жеребца, что поможет вести точные записи о результатах каждого охлажденного эякулята и о кобылах, которых нужно осеменить. При наличии достаточного количества спермы некоторое ее количество, подготовленное таким же образом, как и присланная партия, нужно сохранить в первоначальном питомнике, чтобы потом можно было оценить качество спермы после 24 часов хранения.
ВЫВОДЫ
При осеменении кобыл транспортированной охлажденной спермой ведущую роль играет ветеринар, который осуществляет качественный контроль (за качеством спермы, дозой осеменения, временем осеменения и т.д.). Требуются значительные усилия, чтобы избежать соперничества между владельцами жеребцов/директорами питомников, владельцами кобыл и ветеринарами, работающими с жеребцами и кобылами. Для успешного возникновения беременности после каждого осеменения все эти стороны должны действовать совместно.