Глава 5.13

Эндокринная диагностика жеребцов на недостаточность репродуктивной функции

ДЖАНЕТ Ф. РОУЗЕР

Дейвис, Калифорния

ГИПОТАЛАМО-ГИПОФИЗАРНО-ЯИЧКОВАЯ СИСТЕМА

У многих видов млекопитающих, в том числе у жеребцов, нормальный сперматогенез зависит от функциональной гипоталамо-гипофизарно-яичковой системы (НТР), которая запускает классические механизмы обратной связи. В превосходном обзоре, выполненном Аманном, по физиологии и эндокринологии репродуктивной функции жеребцов рассматривается роль НТР в сперматогенезе. Роузер с коллегами предоставляют дополнительные данные по эндокринологии, касающиеся влияния половых гормонов на жеребца в пределах НТР системы (рис. 5.13-1). Иными словами, гонадотропный рилизинг-гормон (GnRH), вырабатываемый гипоталамусом, стимулирует выработку гипофизом и секрецию лютеинизирующего гормона (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), которые в свою очередь стимулируют яички вырабатывать и выделять такие важные для сперматогенеза гормоны, как тестостерон (Т), эстроген и ингибин. Гормоны, вырабатываемые яичками, очевидно, обладают либо отрицательным, либо положительным эффектом обратной связи на гипоталамус и/или гипофиз. Согласно недавним исследованиям, Т в основном действует на уровне гипоталамуса, подавляя GnRH. Эстроген действует на уровне гипофиза, усиливая влияние GnRH на выработку и выброс ЛГ. Ингибин, по-видимому, является основным гормоном, подавляющим выброс ФСГ. Роль Т и/или эстрогена в регуляции ФСГ на уровне гипофиза неизвестна. Также невыясненной остается роль эстрогена в регуляции GnRH на уровне гипоталамуса

Кроме того, факторы паракринной/аутокринной систем, возможно, также участвуют в модуляции влияния половых гормонов на функции яичек. Паракринная/аутокринная система, открытая относительно недавно, очевидно, участвует в осуществлении местных процессов. Факторы паракринной системы выделяются из клетки яичка и действуют на различные виды клеток яичек. Факторы аутокринной системы выделяются из клетки яичка и воздействуют на свой собственный вид клеток.

Такие факторы в настоящее время считаются важными модуляторами половых процессов у многих видов млекопитающих. Они включают тестостерон, эстроген, ингибин, факторы роста, трансферрин, цитокины и многие другие. Данные, недавно полученные в лаборатории автора данной статьи, говорят о том, что идиопатическая недостаточность репродуктивной функции может возникать вследствие дисфункции яичек, вызванной уменьшением факторов паракринной/аутокринной системы (рис. 5.13-2). За исключением GnRH и некоторых факторов паракринной/аутокринной системы, с диагностической целью можно исследовать половые гормоны в периферической крови. К сожалению, действительное измерение паракринных/аутокринных факторов в яичках осуществляется лишь в процессе анализа ткани яичек посредством биопсии. Недавнее исследование, проведенное Фейбер и Роузер, биопсия яичек проводится без выраженных побочных эффектов, но в целом данная процедура несет в себе некоторый риск.

НЕДОСТАТОЧНОСТЬ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ У ЖЕРЕБЦОВ И ХАРАКТЕРИСТИКИ ЭНДОКРИННОЙ СИСТЕМЫ

Недостаточность репродуктивной функции определяется с помощью количества жеребостей на цикл (< 20-30 % на цикл; в норме > 50 % на цикл) или количества жеребостей в сезон (< 60 % в сезон; в норме > 80 % в сезон). Она может быть вызвана изменениями количества сперматозоидов и/или их подвижности, изменениями текстуры яичек и/или дегенерацией яичек. Разумеется, существуют некоторые заболевания, влияющие на фертильность жеребца, которые не имеют никакого отношения к эндокринной системе, например, гемоспермия, уроспермия, венерические заболевания, новообразования и вирусные и бактериальные инфекции. В таких случаях диагностика эндокринной системы не имеет смысла. Она эффективна в случаях идиопатической недостаточности репродуктивной функции или дегенерации яичек, особенно при определении локализации заболевания. Изменение нормальных характеристик эндокринной системы не обязательно означает, что данная проблема является эндокринной по своему происхождению. Возможно, она является результатом первичной неэндокринной дисфункции.

ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НТР СИСТЕМЫ

При заборе проб крови для исследования половых гормонов врач должен иметь в виду следующее:

• Секреция гормонов в течение дня может меняться, поэтому важно взять более одной пробы крови для получения средних исходных данных. Рекомендуется взятие шести проб через каждый час в один и тот же день между 10 утра и 15 часами. В другом случае при необходимости лишь приблизительной оценки данных берут только три пробы крови, раз в день в течение 3 дней в одно и то же время.

• Исходная концентрации гормонов может увеличиваться и уменьшаться в течение дня, и некоторые гормоны, например, тестостерон, достигают наибольших уровней в середине дня. Для сравнения необходимо систематически собирать пробы в определенное время дня. Важное значение имеет не столько конкретное время дня, как соблюдение одного и того же времени для взятия многочисленных проб у одних и тех же или разных животных.

• Концентрации гормонов у фертильных жеребцов различны. Концентрации должны быть в пределах нормального диапазона. Нормальный диапазон в разных лабораториях может варьироваться из-за использования различных реагентов и анализов для исследования проб. Каждая лаборатория предоставляет свои собственные значения в рамках нормального диапазона.

• Существуют сезонные различия: наивысшие уровни гормонов определяются в период сезона спаривания (март-сентябрь) и наименьшие в сезон, когда спаривание не проводят (октябрь-февраль).

• Для исследования характеристик эндокринной системы используются плазменные или сывороточные пробы.

• Обычно 10 мл пробы крови достаточно для измерения ЛГ, ФСГ, Т, эстрадиола и ингибина в крови.

Рис. 5.13-1. Гипоталамо-гипофизарно-яичковая система (НРТ) жеребца. GnRH – гонадотропный рилизинг-гормон; ЛГ – лютеинизирующий гормон; ФСГ – фолликулостимулирующий гормон; Т – тестостерон; Е – эстрадиол, Inh – ингибин; L – интерстициальный эндокриноцит, S – сустентоцит.

Надписи на рис. 5.13-1: 1 – НРТ система; 2 – ЛГ и ФСГ; 3 – аутокринный; 4 – паракринный.

Рис. 5.13-2. Предположительные процессы, которые могут возникать после первоначального уменьшения паракринных/аутокринных факторов яичек в результате воздействия таких факторов, как токсины, лекарственные препараты, стресс, стероиды и нарушения питания и генетики. ФСГ – фолликулостимулирующий гормон; ЛГ – лютеинизирующий гормон; Т – тестостерон. (Приведено с изменениями из статьи Роузер Дж.Ф. «Эндокринная основа функции яичек у жеребцов». Териогенология, 1997; № 48, стр. 883-892).

Надписи на рис. 5.13-2.

1 – факторы воздействия? (токсины, лекарственные препараты, стресс, стероиды, питание, генетика); 2 – паракринное/аутокринное нарушение яичек; 3 – дисфункция сустеноцитов; 4 – дисфункция интерстициальных эндокриноцитов; 5 – дисфункция сперматозоидов; 6 – дисфункция яичек; 7 – дегенерация; 8 – нарушение гормонального равновесия, ингибин, эстроген, ФСГ; 9 – ЛГ, Т 10 – недостаточность репродуктивной функции/бесплодие.

ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭНДОКРИННЫХ, ПАРАКРИННЫХ И АУТОКРИННЫХ ФАКТОРОВ

Концентрации лютеинизирующего, фолликулостимулирующего гормонов, эстрадиола, ингибина и тестостерона в сыворотке и плазме

Для получения точных исходных данных из яремной вены каждый час с 10 до 15 часов в один и тот же день берут 10 мл венозной крови. При менее точных исследованиях также имеет смысл брать 10 мл венозной крови ежедневно в течение 3 дней между 9 и 10 часами утра. До обработки пробы крови хранят при температуре 4º С. Через пару часов плазму или сыворотку удаляют и до проведения исследования пробу хранят при температуре -20º С. Данные, полученные из шести проб крови, взятых через каждый час, показывают подъем уровня тестостерона в середине дня. Аналогичным образом кровь исследуют на содержание ЛГ. Возникающая в то же время взаимосвязь между ЛГ и Т показывает, что ЛГ соответственно стимулирует выработку Т яичками. У жеребца с недостаточностью репродуктивной функции, имеющего заболевание яичек, может наблюдаться подъем ЛГ без соответствующего подъема Т. В целом, согласно ранним исследованиям, у жеребца с пониженной плодовитостью наблюдаются изменения уровней гормонов в следующем порядке: (1) увеличение уровня ФСГ, (2) уменьшение уровней эстрадиола и ингибина, (3) уменьшение уровней ЛГ и наконец, когда жеребец уже бесплоден (4) понижение уровня тестостерона. Такие изменения могут длиться в течение нескольких месяцев или лет, в зависимости от имеющегося нарушения. Если ежечасное взятие проб крови непрактично, для нормальной оценки недостаточности репродуктивной функции можно брать пробы крови в течение трех дней подряд.

Однократное введение гонадотропного рилизинг-гормона

Для исследования реакции функции гипофиза и яичек в 9 часов утра внутривенно (в/в) вводят 25 мкг GnRH (Cystorelin, Merial). Сбор крови производят за 30 минут до этого, во время инъекции и каждые 30 минут после инъекции в течение 2 часов. До обработки образцы крови хранят при температуре 4º С. Через пару часов плазму или сыворотку удаляют и до исследования на содержание ЛГ и Т хранят при температуре -20º С.

Патологическая реакция на одно введение помогает диагностировать нарушение гипоталамо-гипофизарное нарушение и/или нарушение яичек, как показано на рис. 5.13-3 и 5.13-4. На этих рисунках жеребцы с недостаточностью репродуктивной функции имеют низкую реакцию гипофиза и яичек, что говорит о первичном заболевании либо гипофиза, либо яичек. Следующей стадией для определения возможного заболевания яичек является введение человеческого хорионического гонадотропина (hGG) (см. введение hGG). В других случаях для выявления недостаточности репродуктивной функции наряду с введением GnRH может помочь измерение количества гормонов в плазме. Например, у жеребцов с низким исходным уровнем ЛГ, но с хорошей реактивностью на введение экзогенного GnRH, бывают проблемы с гипоталамусом, то есть он не в состоянии вырабатывать или выделять нормальное количество GnRH. Данный синдром носит название гипогонадотропного гипогонадизма.

Рис. 5.13-3 на с. 259. Временные изменения средней реакции лютеинизирующего гормона (ЛГ), выраженные в процентах по отношению к внутривенному (в/в) введению 25 мкг экзогенного гонадотропного рилизинг-гормона (GnRH) фертильным жеребцам и жеребцам с недостаточностью репродуктивной функции. (Приведено с изменениями из статьи Роузер Дж.Ф., Хьюс Дж.П. Влияние GnRH в зависимости от дозы на гонадтропины и тестикулярные стероиды у плодовитых и жеребцов с недостаточностью репродуктивной функции. Журнал андрологии, 1992b, № 13, стр. 543-550).

Надписи на рис. 5.13-3 (слева): 1 – реакция ЛГ (в % от исходных данных); 2 – плодовитость; 3 – недостаточность репродуктивной функции.

Рис. 5.13-4 на с. 259. Временные изменения средней реакции тестостерона (Т), выраженные в процентах по отношению к внутривенному (в/в) введению 25 мкг экзогенного гонадотропного рилизинг-гормона (GnRH) фертильным жеребцам и жеребцам с недостаточностью репродуктивной функции. (Приведено с изменениями из статьи Роузер Дж.Ф., Хьюс Дж.П. Влияние GnRH в зависимости от дозы на гонадтропины и тестикулярные стероиды у плодовитых жеребцов и жеребцов с недостаточностью репродуктивной функции. Журнал андрологии, 1992b, № 13, стр. 543-550).

Надписи на рис. 5.13-3 (слева): 1 – реакция Т (в % от исходных данных); 2, 3 – см. рис. 5.13-3.

Трехкратное введение гонадотропного рилизинг-гормона

Для исследования реакции функции гипофиза на введение эндогенного GnRH необходимо ввести несколько небольших порций этого гормона. Такое исследование также помогает определить выделение гормонов яичками. Три небольших внутривенных дозы (5 мкг/доза) GnRH (Cystorelin, Merial) вводят, начиная с 9 часов утра с интервалом в 1 час в сезон, когда спаривание не проводят. Реакция ЛГ по сравнению с исходными данными является более выраженной в сезон, когда спаривание не проводят, в период наименьшей активности системы HPT. Пробы крови берутся за 30 минут до первой инъекции, а затем через каждые 10 минут на протяжении всего исследования. Весь процесс занимает 3,5 часа. До начала обработки пробы крови хранят при температуре 4º С. Через пару часов плазму или сыворотку удаляют и до исследования на содержание ЛГ и хранят при температуре -20º С. Такое исследование позволяет точно оценить функцию гипофиза при воздействии нескольких дозировок. Также исследуется способность яичек выделять необходимые гормоны для получения нужного эффекта, например, эстрогены. Нормальное воздействие наблюдается при систематическом выделении большого количества ЛГ после каждого введения. По сравнению с фертильными жеребцами у жеребцов с недостаточностью репродуктивной функции наблюдается значительно пониженная реакция при втором и третьем введении GnRH в сезон, когда спаривание не проводят (рис. 5.13-5).

Рис. 5.13-5. Временные изменения реакции лютеинизирующего гормона (ЛГ), у плодовитых жеребцов (черные значки) и жеребцов с недостаточностью репродуктивной функции (светлые значки) в период сезона спаривания (квадратики) и сезона отсутствия спаривания (кружки). Реакции приводятся в зависимости от исходных данных, выраженных в процентах, по отношению к трем дозам экзогенного гонадотропного рилизинг-гормона (GnRH; 5 мкг), вводимых внутривенно с интервалами 0, 60 и 120 минут. (Приведено с изменениями из статьи Роузер Дж.Ф., Хьюс Дж.П. Сезонные изменения качества семенной жидкости. Концентрация гормонов в плазме и вызванной GnRH реакции ЛГ у фертильных жеребцов и жеребцов с недостаточностью репродуктивной функции. Журнал андрологии, 1992a, № 13, стр. 214-223).

Надписи на рис. 5.13-3 (слева): 1 – ЛГ (в % от исходных данных); 2 – время (мин).

Введение человеческого хорионического гонадотропина

Для исследования реакции яичек в 9 часов утра в/в вводят одну дозу hGG (10,000 МЕ: Choluron; Intervet, Милсборо, Делавэр). Пробы крови берут с интервалом в 30 минут и через 1, 2, 4, 6, 12 и 60 часов. Возникает двухфазная реакция, при этом первое повышение наблюдается через 12 часов, а второе – через 60 часов (рис. 5.13-6). У большинства здоровых жеребцов через 3 часа наблюдается двукратное и четырехкратное повышение уровня тестостерона. До начала обработки пробы крови хранят при температуре 4º С. Через пару часов плазму или сыворотку удаляют и до исследования на содержание Т и хранят при температуре -20º С. Поскольку воздействие hGG непосредственно оказывает стимулирующее действие на яички, слабая реакция Т наряду с ЛГ и низким уровнем тестостерона в крови говорит о том, что проблема заключается в яичках. Исследование фертильных, бесплодных жеребцов и жеребцов с недостаточностью репродуктивной функции показало, что лишь у бесплодных жеребцов наблюдалась слабая реакция яичек на hGG (см. рис. 5.13-6). Более низкая доза hGG (2500-5000 МЕ), возможно, окажет более эффективное действие для выявления жеребцов с недостаточностью репродуктивной функции.

Биопсия яичек

Проведение биопсии яичек помогает исследовать эндокринные, паракринные и аутокринные факторы ткани яичек, и она проводится в стерильных условиях. Для получения трех биопсийных пунктатов с помощью подпружиненного биопсийного инструмента (Bard Inc., Ковингтон, Джорджия), прикрепленного к раздвоенной игле 14 размера, жеребца привязывают к опоре и вводят ему комбинацию седативных средств, например, детомидин гидрохлорид (Dormosedan) с буторфанолом тартратом (Norbugesic). Проводится асептическая подготовка мошонки путем обработки йодом, а затем осуществляется подкожная анестезия примерно 1 мл 2 % (в/в) раствора лидокаина гидрохлорида. В мошонке делают небольшой разрез в центре краниолатеральной четверти наиболее пораженного яичка. Яичко удерживают в мошонке. Стерильную раздвоенную иглу 14 размера, присоединенную к подпружиненному биопсийному инструменту, вводят в разрез влагалищной оболочки, впоследствии прижигают по мере проникновения иглы в паренхиму яичка, а затем вынимают ее.

Берут две последовательные пробы через один и тот же разрез, но слегка под разными углами. Оба пунктата помещают в 1,2 мл фосфатного буферного физиологического раствора, замораживают в сухом льду и спирте или жидком азоте и хранят в замороженном виде при температуре -70º С до исследования эндокринных/паракринных/аутокринных факторов. Третью пробу хранят в растворе Буина в течение 6 часов, затем переносят в 50 % спирт, а потом проводят гистологическое исследование. Недавнее исследование уровней гормонов яичек у фертильных, бесплодных жеребцов и жеребцов с недостаточностью репродуктивной функции показало, что уровни ингибина во фрагментах яичек могут являться ранними показателями снижающейся плодовитости.

Рис. 5.13-6. Временные изменения средней концентрации тестостерона в плазме до и после введения hCG (человеческого хорионического гонадотропина, 10.000 МЕ) или физиологического раствора, вводимого внутривенно в 0 точку отсчета фертильным, бесплодным жеребцам и жеребцам с недостаточностью репродуктивной функции. (Приведено с изменениями из статьи Роузер Дж.Ф. Эндокринные факторы у фертильных, бесплодных жеребцов и жеребцов с недостаточностью репродуктивной функции: реакция яичек на введение hCG у бесплодных жеребцов. Biol Reprod Mono, 1995, № 1, стр. 661-669).

Надписи на рис. 5.13-6: 1 – тестостерон (нг/мл); 2 – время после введения (час); 3 – фертильные; 4 – с недостаточностью репродуктивной функции; 5 – бесплодные.