Глава 5.20

Сбор, хранение и пересадка эмбрионов

ДИРК К. ВАНДЕРУОЛЛ

Москва, Айдахо

Пересадка эмбрионов все еще является наиболее распространенным репродуктивным методом искусственного оплодотворения, применяемым у кобыл. Данная методика обычно используется для получения (1) жеребят от выездных кобыл, (2) нескольких жеребят от определенной кобылы каждый год, (3) жеребят от кобыл в возрасте двух лет, (4) жеребят от кобыл с патологией репродуктивной системы и (5) жеребят от кобыл с заболеваниями, не связанными с репродуктивной системой. Несмотря на то, что первоначально пересадка эмбрионов была многообещающим методом для получения жеребят от пожилых кобыл и кобыл с недостаточностью репродуктивной функции, эксперименты с пересадкой ооцитов и эмбрионов показали, что многие ооциты/эмбрионы, вырабатываемые пожилыми кобылами и кобылами с недостаточностью репродуктивной функции, после пересадки кобылам-реципиентам являются наследственно дефектными и обладают низкой жизнеспособностью. Поэтому пожилые кобылы и кобылы с недостаточностью репродуктивной функции не являются оптимальными кандидатами для пересадки эмбрионов.

Первая успешная пересадка эмбриона лошади была проведена в начале 1970-х годов; однако, лишь в начале 1980-ых гг. пересадка эмбрионов стала общепринятой клинической процедурой в индустрии разведения лошадей. На тот период времени широкое распространение пересадки эмбрионов ограничивалось вследствие необходимости держать кобыл-реципиентов в месте сбора эмбрионов или транспортировки кобыл-доноров в централизованную лабораторию для пересадки эмбрионов. В конце 1980-ых гг. был изобретен метод охлаждения эмбрионов лошадей, с разработкой практической методики кратковременного (< 24 часов) хранения и транспортировки эмбрионов лошадей. Такое крупное научное достижение позволило собирать эмбрионы в «полевых условиях», а затем перевозить их в централизованные лаборатории для пересадки подходящим кобылам-реципиентам. Возможность транспортировки охлажденных эмбрионов позволила ветеринарам осуществлять пересадку без обременительного содержания кобыл-реципиентов и транспортировки кобыл-доноров в централизованную лабораторию. В данной главе рассмотрены современные методы сбора, хранения и пересадки эмбрионов лошадей. Процедуры, используемые для ухода за репродуктивной системой и синхронизации процессов у кобылы-донора и кобылы-реципиента приведены в других главах данного издания.

СБОР ЭМБРИОНОВ

Эмбрионы лошадей избирательно вводят через фаллопиевы трубы в матку между 5 и 6 днями после овуляции (овуляция = 0 день), в этот период они находятся на поздней стадии перехода из морулы в стадию бластоцисты. В отличие от этого, неоплодотворенные ооциты остаются в фаллопиевых трубах, где в течение нескольких месяцев подвергаются разрушению. Несмотря на то, что эмбрионы могут обнаруживаться на 6-9 день после овуляции, время сбора эмбрионов зависит от нескольких факторов. Эмбрионы, пересадка которых производится сразу же после сбора или охлажденные для кратковременного хранения перед пересадкой, обычно собирают на 7-8 день после овуляции, а эмбрионы, которые будут подвергнуты заморозке для длительного хранения, собирают на 6 день после овуляции. Как правило, на 9 день сбор эмбрионов не проводят, поскольку успешность их пересадки обычно ниже, чем на 7 или 8 дни после овуляции. Менее успешные результаты пересадки эмбрионов на 9 день после овуляции, однако, зависят от хирургической процедуры пересадки. Недавние результаты, полученные при нехирургической пересадке, показали, что ее успех на 9 день после овуляции равносилен успеху пересадки эмбрионов на 7 и 8 дни после овуляции.

Помимо этих факторов, день сбора эмбрионов может зависеть от личных предпочтений и составленного расписания ветеринара. В настоящее время автор данной статьи считает, что сбор эмбрионов нужно проводить на 8 день после овуляции для эмбрионов, пересадка которых будет произведена сразу же после сбора, или охлажденных эмбрионов для кратковременного хранения перед пересадкой.

Сбор эмбрионов проводится с помощью трансцервикального маточного лаважа (рис. 5.20-1). Перед началом процедуры область промежности у кобылы промывают слабым моющим средством, тщательно ополаскивают чистой водой и протирают насухо. Затем врач-хирург одевает на руку стерильную пластиковую перчатку, наносит на нее стерильную мазь, а затем вводит стерильный катетер с наконечником в виде баллона во влагалище кобылы. Автор данной статьи использует 80-см силиконовый катетер (VEUF, Bivona, Гари, Индиана) с внутренним диаметром 8 мм (Французский размер 33); однако, имеются также и другие виды промывных катетеров. После введения катетера во влагалище инструмент проводят через канал шейки матки в полость матки, а манжету баллона наполняют примерно 80 мл воздуха или стерильного физиологического раствора и оттягивают назад по отношению к внутреннему цервикальному отверстию для предупреждения вытекания жидкости. После правильного размещения катетера матку промывают три или четыре раза теплым (30-35º С) водным раствором.

Наиболее распространенным водным раствором является фосфатный буферный раствор Дулбекко, в котором содержится 1 % (в объемном отношении) сыворотка зародышевого или новорожденного теленка, пенициллин (100 Ед/мл) и стрептомицин (10 мкг/мл). Однако недавно многие лечащие ветеринары начали применять цвиттер-ионно-буферный водный раствор, содержащий антибиотики и бычий сывороточный альбумин (emCare Complete Flush Solution, Professional Embryo Transfer Supply, canton, Техас) или поливиниловый спирт (Vigro Complete Flush Solution, AB Nechnology, Pullman, Вашингтон). Независимо от выбранного водного раствора, во время каждого промывания матку заполняют самотеком 1-2 л раствора (4-8 л за всю процедуру). После заполнения матки жидкости позволяют вытечь через катетер и пройти через эмбрионный фильтр с диаметром отверстий 0,75 мкм. Эмбрионный фильтр не должен переполняться и высыхать; имеются фильтры, устройство которых позволяет предотвратить оба эти случая. Жидкость, вытекающую через фильтр, собирают, следя за появлением эмбриона. После первого промывания проводятся последующие, во время которых ветеринар массирует матку через прямую кишку. При таком массаже эмбрион(ы) находятся во взвешенном состоянии в растворе и улучшается отток жидкости. Большая часть (> 90 %) жидкости, введенной в матку, вытекает из нее и не содержит оболочек клеток или крови. Отток мутной жидкости говорит о том, что у кобылы во время сбора эмбриона имелся активный эндометрит, и требуется дальнейшее диагностическое исследование. Причиной загрязнения воды кровью обычно бывает энергичный массаж матки и/или манипуляции с катетером.

По окончании промывания содержимое эмбрионного фильтра очищают в стерильное блюдо с ситечком, а фильтр промывают примерно 50 мл воды. Затем жидкость исследуют на наличие эмбриона(ов) с помощью стереомикроскопа примерно при 15-кратном увеличении. Большие эмбрионы (≥ 8 день после овуляции) обычно видны невооруженным глазом. При обнаружении эмбриона его промывают, последовательно перенося его через несколько (3-10) 1-мл капель закрепляющей среды, которая состоит из обогащенной формулы промывного раствора. После промывания эмбрион помещают в небольшую чашку Петри, содержащую аналогичную среду. Затем эмбрион исследуют при многократном увеличении (40-80 х) и оценивают по шкале от 1 балла (отличный) до 4 (слабый) баллов. Эмбрионы еабирают в соломинку для замороженных эмбрионов емкостью 0,25 или 0,5 мл, стеклянной капиллярной пипеткой или другим аналогичным инструментом, прикрепленным к шприцу. Каждый раз при извлечении эмбриона соответствующим инструментом, в среду, где он находится, вводят с обеих сторон по пузырьку воздуха и чистый раствор. Таким образом, это предохраняет эмбрион от случайного вытаскивания инструментом из-за соприкосновения его наконечника с каким-либо абсорбентом.

После помещения эмбрионов в закрепляющую среду их нужно быстро ввести в соответствующую кобылу-реципиента или обработать для хранения (см. ниже). В ожидании немедленного переноса эмбрионов кобыле-реципиенту или обработки для хранения эмбрионы лошадей хорошо сохраняются при температуре между комнатной (25º С) и температурой тела (37º С); однако нужно принять меры по предупреждению быстрых и резких изменений температуры и сокращению времени хранения эмбрионов в закрепляющей среде.

Как уже было сказано выше, неоплодотворенные ооциты сохраняются в фаллопиевой трубе, где в течение нескольких месяцев они подвергаются распаду; поэтому обычно их нельзя обнаружить при сборе эмбрионов. Однако иногда при сборе эмбрионов можно обнаружить один или два старых дегенерирующих неоплодотворенных ооцита с предыдущих эстральных циклов. Такие старые дегенерирующие ооциты неизменно имеют овальную и/или уплощенную форму, что придает им вид футбольного мяча или блина. Врачу-хирургу приходится осторожно капать из пипетки и/или слегка вращать чашку с эмбрионом при рассмотрении его через стереомикроскоп, чтобы разглядеть этот характерный вид. Хотя старые дегенерирующие ооциты редко можно обнаружить в матке, их нужно отличать от жизнеспособных эмбрионов, чтобы время и деньги не были потрачены впустую для пересадки нежизнеспособных ооцитов кобыле-реципиенту (или доставку эмбриона в лабораторию по пересадке эмбрионов).

Рис. 5.20-1. Метод трансцервикального лаважа матки для обнаружения эмбрионов. (Приведено с изменениями из статьи Агилар Дж., Вудс Г.Л.: Пересадка эмбрионов у лошадей: показания, методика проведения и ожидаемые результаты. В книге под ред. Янгквиста Р. (изд): Современное лечение в териогенологии крупных животных, стр. 208-213, Филадельфия, У.Б. Саундерс, 1997).

Надписи на рис. 5.20-1:

1- надувная манжета, 2 – яичник, 3 – фаллопиева труба, 4 – матка, 5 – шейка матки, 6 – прямая кишка, 7 – раствор для промывания, 8 – влагалище, 9 – мочевой пузырь, 10 – входное отверстие манжеты, 11 – эмбрионный фильтр

ХРАНЕНИЕ ЭМБРИОНОВ

Для хранения эмбрионов лошадей существуют два варианта. При кратковременном хранении (< 24 часов) эмбрионы охлаждают до 5º С в Equitainer (Hamilton research, Саут Гамильтон, Массачусетс). При длительном хранении (> 24 часов) эмбрионы замораживают до -196º С в жидком азоте. Из этих двух вариантов кратковременное хранение в настоящее время более практично и широко используется для транспортировки эмбрионов в коммерческих программах по пересадке эмбрионов. Эмбрионы охлаждают (и транспортируют) в питательной среде Ham’s F-10. Перед использованием на основе среды Ham’s F-10 создается буферный раствор путем диффундирования в нем смеси медицински чистых сжатых газов 90 % N₂, 5 % O₂ и 5 % CO₂ в течение 3-5 минут, после чего в него добавляют 10 % (в объемном отношении) сыворотки зародыша или новорожденного теленка, пенициллин (100 Ед./мл) и стрептомицин (100 мкг/мл). Поскольку перед употреблением среда Ham’s F-10 должна быть насыщена газом, для этого понадобится баллон для сжатого газа с регулятором. Поэтому многие ветеринары предпочитают приобретать устройство для пересадки эмбрионов с Ham’s F-10 в качестве составной части комплекта дл пересадки эмбрионов. Однако после того как Ham’s F-10 была подготовлена к употреблению, срок хранения ее ограничен, и поэтому нужно осуществлять срочную доставку такой среды, чтобы она была получена в течение 24 часов до назначенного сбора эмбриона. К сожалению, расходы, связанные с подготовкой и транспортировкой Ham’s F-10 ветеринару, будут напрасными, если не удастся получить эмбрионы, поскольку Ham’s F-10 нельзя хранить для будущего употребления. Из-за необходимости специализированного оборудования для обработки Ham’s F-10 и ее ограниченного срока хранения в настоящее время проходят исследование другие питательные среды для охлаждения и хранения эмбрионов лошадей.

Для помещения эмбрионов в Ham’s F-10 готовую среду пропускают через стерильный фильтр в 5 мл пробирку с пластмассовой крышкой и небольшим отверстием для поступления воздуха в верхней части пробирки. Затем в эту среду осторожно переносят эмбрион. Пробирку закрывают крышкой и заворачивают в парафильм (растягивающуюся пленку для закупорки лабораторной посуды – прим перев.) (American National Can, Menasha, Висконсин). Центрифужную пробирку емкостью 50 мл заполняют средой Ham’s F-10 (не фильтрованной) и помещают 5 мл пробирку с эмбрионом в 50-мл центрифужную пробирку. Крышку 50 мл центрифужной пробирки закрывают, удалив из нее как можно больше воздуха, и заворачивают в парафильм. Затем упакованный эмбрион помещают в Equitainer, который медленно охлаждает эмбрион до 5º С. При таких условиях эмбрионы сохраняют жизнеспособность по крайней мере 24 часа, что позволяет перевозить их по воздуху или доставлять ночным рейсом в лаборатории по пересадке эмбрионов, где производится пересадка данного эмбриона соответствующей кобыле-реципиенту. За последние десять лет широкое применение охлажденных эмбрионов в коммерческих программах по пересадке эмбрионов доказало, что частота возникновения беременностей при пересадке охлажденных эмбрионов соответствует частоте, достигаемой при пересадке эмбрионов сразу же после сбора.

Сохранение эмбрионов при низкой температуре

В отличие от охлажденных эмбрионов, которые можно хранить в среде Ham’s F-10 в течение 24 часов, эмбрионы, замороженные в жидком азоте, можно хранить в течение длительного периода. Возможность длительного хранения замороженных эмбрионов предоставляет три следующих преимущества:

1. Эмбрионы могут быть получены от кобылы донора независимо от наличия подходящей кобылы-реципиента, поскольку эмбрион может быть заморожен, а затем в оттаявшем виде пересажен кобыле-реципиенту гораздо позже.

2. Эмбрионы можно перевозить в любую часть света, что нельзя осуществить с охлажденными эмбрионами.

3. Эмбрионы можно «накапливать» в качестве страхового полиса на случай преждевременной смерти кобылы.

В процессе замораживания и последующего оттаивания эмбрионы находятся в чрезвычайно неестественных условиях; поэтому используются специальные методы сохранения эмбрионов при низкой температуре, чтобы уменьшить их повреждение в подобных условиях. Современные методы сохранения эмбрионов при низкой температуре распадаются на две группы: традиционные методы и витрификация. При традиционных методах для сохранения эмбрионов при низких температурах перед заморозкой нужно удалить большую часть внутриклеточной жидкости из клеток эмбриона. Если это не сделать, образуются большие внутриклеточные кристаллы льда, которые вызывают тяжелые физические повреждения клеток и/или их гибель. Жидкость удаляется из клеток осмотическим путем при помощи охлаждения/замораживания под тщательным наблюдением. Если охлажденные/замороженные эмбрионы находятся во взвешенном состоянии в физиологической среде, раньше всего замораживается жидкость, находящаяся во внеклеточном пространстве. Кристаллы льда, которые образуются во внеклеточном пространстве, состоят из довольно чистой воды, которая получается из размороженной жидкости во внеклеточном пространстве с более высокой концентрацией раствора (гиперосмотический раствор). Гиперосмотическая жидкость во внеклеточном пространстве затем вытягивает воду из клеток эмбрионов, обезвоживая их. При слишком быстром охлаждении/замораживании эмбрионов вода внутри клеток замораживается до ее осмотического удаления и поражения/гибели клеток. В отличие от этого, при слишком медленном охлаждении/замораживании эмбрионов клетки подвергаются слишком высокой концентрации раствора, что также приводит к повреждению и/или гибели клеток. Таким образом, нужно тщательно следить за скоростью охлаждения/замораживания для предупреждения обезвоживания клеток, которое происходит в процессе замораживания. Тщательный контроль за скоростью охлаждения/замораживания достигается при помощи аппаратуры с программным управлением для замораживания эмбрионов.

Для улучшения выживания клеток при выполнении процедур сохранения эмбрионов при низкой температуре в среду для замораживания добавляют криозащитные вещества. Существуют две группы криозащитных веществ: проникающие, внутриклеточные криозащитные вещества, например, глицерин, диметилсульфоксид (DMSO) и этиленгликоль и непроникающие, внеклеточные криозащитные вещества, например, сахароза и сывороточный альбумин. Обычно применяются как проникающие, так и непроникающие криозащитные вещества; однако наиболее важное значение имеют проникающие криозащитные вещества. Механизм действия криозащитных веществ неизвестен, но, возможно, они вызывают понижение температуры замораживания среды и/или оказывают влияние на физическую структуру льда.

Хотя проникающиекриозащитные вещества необходимы для традиционных методов сохранения эмбрионов при низкой температуре, попадание проникающих криозащитных веществ внутрь клеток эмбрионов усложняет процесс оттаивания. При оттаивании эмбрионов и помещении их вслед за этим в среду, не содержащую криозащитных веществ (или телесной жидкости), вода потечет в эмбрионные клетки и растворит осмотическим путем криозащитное вещество до того, как оно сможет выйти из клеток. Такой приток воды происходит из-за того, что клетки гораздо в большей степени проницаемы для воды, чем для многих криозащитных веществ. Быстрое поступление воды может повредить клетки, вызывая быстрое осмотическое разбухание до такой степени, что может произойти лизис клеток. Для решения данной проблемы существуют два метода – разведение проникающего криозащитного вещества последовательно мелкими порциями или помещение эмбриона в среду с довольно высокой концентрацией непроникающего внеклеточного криозащитного вещества. Оба метода обеспечивают медленное уравновешивание проникающего криозащитного вещества без проникновения повышенного количества жидкости в клетки эмбриона.

Витрификация

В отличие от традиционных методов сохранения эмбрионов при низких температурах, при витрификации используются повышенные концентрации проникающих криозащитных веществ, в результате чего внутриклеточная и внеклеточная жидкости чаще приобретают повышенную вязкость в процессе охлаждения/замораживания и реже образуют кристаллы льда. Отсутствие вредных кристаллов льда является главным преимуществом данного метода. При витрификации также устраняется необходимость медленного охлаждения эмбрионов, в результате чего не требуется дорогая аппаратура с программным управлением для замораживания, поскольку упакованные эмбрионы можно сразу же погрузить в жидкий азот для замораживания. Главным недостатком витрификации является то, что высокая концентрация применяемого криозащитного вещества может оказаться токсичной для эмбрионов. Ветеринар может уменьшить токсичность, сократив время воздействия криозащитного вещества перед замораживанием, добавляя криозащитное вещество при низких температурах и сразу же после оттаивания быстро убирая криозащитное вещество.

В настоящее время методы традиционного сохранения эмбрионов при низкой температуре с использованием глицерина в качестве главного криозащитного вещества считается наиболее подходящим для длительного хранения эмбрионов лошадей. Однако размер эмбриона оказывает значительное действие на частоту возникновения беременностей, достигаемую после сохранения эмбрионов при низкой температуре. Было доказано, что небольшие (≤ 250 мкм) эмбрионы на ранних стадиях развития (поздняя стадия развития морулы до начальных стадий бластоцист) выдерживают сохранение при низкой температуре лучше, чем эмбрионы более крупных размеров (≥ 300 мкм) на более поздних стадиях от бластоцисты до бластоцисты на поздней стадии). Причина влияния размера эмбриона и/или стадии его развития на перенесение процедур сохранения при низкой температуре эмбрионов лошадей неизвестны. Для получения эмбрионов оптимальных размеров их нужно собирать на шестой день после овуляции. К сожалению, некоторые эмбрионы могут все еще находиться в фаллопиевых трубах, что препятствует их обнаружению, и в то же время некоторые эмбрионы достигают уже 250 мкм в диаметре. Поэтому получение эмбрионов соответствующих размеров/стадии развития с целью охлаждения при низкой температуре вызывает сомнения. Эмбрионы диаметром 250 мкм и менее при замораживании с использованием традиционных методов сохранения при низкой температуре с использованием глицерина после пересадки эмбриона достигается частота возникновения беременностей, равная почти 50 %, в то время как при эмбрионах диаметром 300 мкм и более частота возникновения беременностей после пересадки бывает очень низкой. Для более успешного применения методов сохранения эмбрионов лошадей при низкой температуре необходимы дальнейшие исследованиея Едва ли длительное хранение замороженных эмбрионов лошадей найдет широкое распространение, пока не будут разработаны методы, обеспечивающие выживание крупных эмбрионов на более поздних стадиях (то есть, на 7 и 8 день после овуляции).

ПЕРЕСАДКА ЭМБРИОНОВ

Независимо от того, пересаживают ли эмбрион сразу же после сбора или после хранения (в охлажденном или замороженном виде), пересадку эмбриона можно проводить хирургическим и нехирургическим путями. На сегодняшний день хирургическая пересадка обеспечивает наибольшую частоту возникновения беременностей и наиболее постоянные результаты, при ней частота возникновения беременностей составляет примерно 70-75 % через неделю после пересадки свежих или охлажденных эмбрионов. Однако нехирургическая пересадка быстро получает все большее распространение, а частота возникновения беременностей при ней может быть равной или превышать частоту, наблюдаемую при хирургической пересадке.

Хирургическая пересадка эмбрионов осуществляется посредством боковой лапаротомии в положении стоя с использованием соответствующих седативных средств/транквилизаторов в сочетании с местной анестезией. При стандартном хирургическом методе рог матки выводят через боковой разрез на поверхность тела и производят пункцию острой хирургической иглой. Эмбрион, находящийся в небольшом количестве среды (< 250 мкл) в стерильном инструменте для захвата эмбрионов, затем вводят через разрез в полость матки. После пересадки ветеринар сдвигает рог матки в брюшную полость, не зашивая разрез в стенке матки, а разрез в брюшине зашивает стандартным методом. Из-за внутриматочной подвижности эмбрион лошади может перемещаться в рог матки на той же стороне, где произошла овуляция, или на противоположной стороне.

Нехирургическую пересадку можно осуществить с помощью одного из следующих инструментов:

1. Стандартная пипетка для искусственного осеменения

2. 62,5-см одноразовое пластмассовое «ружье» для имплантации, которое вмещает 0,5-мл соломинку со спермой (продукт #04149; Veterinary Concepts, Spring Valley, Висконсин)

3. 52,5-см «ружье» для имплантации многоразового использования из нержавеющей стали с глубокой камерой, которая вмещает 0,25-мл соломинку со спермой (продукт #04805; Veterinary Concepts).

Автор данной статьи предпочитает использовать 0,25-мл «ружье» для имплантации многоразового использования с глубокой камерой, которое показано на рисунках 5.20-2 – 5.20.4. Эмбрион помещают в стерильную соломинку со спермой емкостью 0,25 мл с пробкой на конце (см. рис. 5.20-2). Заполненную соломинку затем помещают в дистальный конец «ружья» для имплантации, а его помещают в стерильный футляр с металлическим концом и закрепляют пластмассовым наконечником в виде пончика у проксимального конца (см. рис. 5.20-3). Затем перед началом пересадки эмбриона на футляр с металлическим концом помещают наружный стерильный наконечник (см. рис. 5.20-3). При использовании нехирургического метода пересадки эмбриона кобылу реципиента прислоняют к опоре, вводят ей седативный препарат, промывают ей область промежности и готовят к стандартным процедурам. Врач надевает на руку стерильный пластиковый рукав, а сверху на рукав – стерильную хирургическую перчатку. Тыльную сторону руки врача смазывают небольшим количеством стерильной мази, которую наносят на вульву. Наконечник инструмента для пересадки (прикрытый наружным колпачком) берут в ладонь и предохраняют большим пальцем, положив его на наконечник. Инструмент вводят во влагалище, и наконечник с наружным колпачком вводят приблизительно на глубину 0,5 см в наружное цервикальное отверстие, при этом инструмент проводят через наружный колпачок и через шейку матки в полость матки (рис. 5.20-4). Эмбрион можно разместить в теле матки или в одном из рогов матки; чтобы эмбрион попал в один из рогов матки, наконечник инструмента направляют в рог при помощи трансректальных манипуляций.

В настоящее время нет данных о том, что при нехирургическом методе пересадки эмбриона место его размещения (тело матки или рог матки) оказывает влияние на результат. После соответствующей установки инструмента из него изгоняется эмбрион, при этом инструмент слегка оттягивают назад, так, чтобы наконечник не упирался в эндометрий после расположения эмбриона в матке.

Рис. 5.20-2 на с. 283:

Эмбрион помещают в стерильную 0,25 мл соломинку, которую прикрепляют к шприцу с туберкулином, соединенным с мочеточниковым соединительным катетером (продукт #V-050010, Cook Urological, Bloomington, Ind.), который позволяет набирать в соломинку среду и/или воздух. В среде эмбрион помещается посередине между столбиками воздуха и жидкости. Большой столбик жидкости справа от эмбриона (большая стрелка) будет «толкающим» столбиком в среде, который вытолкнет эмбрион из соломинки, когда зонд «ружья» для имплантации будет продвигаться по соломинке. Небольшой столбик в среде на дальнем правом конце соломинки (небольшая стрелка) использовался для смачивания ватного тампона на конце соломинки перед тем, как отделить ее от шприца. Данный метод обеспечивает воздухонепроницаемое уплотнение, благодаря которому содержимое соломинки не выливается из нее до тех пор, пока зонд продвигается по соломинке. После смачивания ватного тампона соломинку отделяют от шприца и помещают в камеру с «ружьем» для имплантации.

Надписи на рис. 5.20-2:

1 Среда

2 Воздух

3 Эмбрион в среде

4 Ватный тампон

Рис. 5.20-3 на с. 284:

Полностью собранное «ружье» для имплантации. Соломинка с эмбрионом закрыта в камере ружья металлическим наконечником, показанном в частичном разрезе (вставка), который удерживается на месте «пончиком» на проксимальном конце ружья. На металлический наконечник снаружи надет твердый стерильный колпачок (имеются и другие виды наружных колпачков).

Надписи на рис. 5.20-3:

1 Эмбрион в соломинке

2 Наружный колпачок

3 Собранное «ружье» для имплантации

4 Ватный тампон

Рис. 5.20-4 на с. 284:

Размещение имплантируемого ружья и эмбриона в полости матки. А Рука в перчатке помогает направить наружный стерильный колпачок на глубину примерно 0,5 см в наружное цервикальное отверстие. После того как наружный колпачок окажется в наружном цервикальном отверстии, колпачок стабилизируют, а имплантируемое ружье (прикрытое металлическим наконечником) проходит через наружный колпачок и продвигается через шейку матки в полость матки. В После того как наконечник «ружья» для имплантации окажется в полости матки, зонд продвигают по ружью, которое выталкивает эмбрион в полость матки. (Приведено с изменениями из статьи Пикет Б.В., Восс Дж.Л., Сквайрес Э.Л и др. «Механика искусственного осеменения». В статье «Сбор, подготовка и осеменение спермой жеребцов: Воспроизведение животных и биотехнологические лабораторные методы, бюллетень № 10, с. 55-71, Форт Коллинз, Колорадо, Колорадский государственный университет, 2000).

Надписи на рис. 5.20-4:

1 Влагалище

2 Шейка матки

3 Тело матки

РЕЗЮМЕ

Пересадка эмбрионов является ценным методом искусственного оплодотворения, способствующим улучшению воспроизведения у кобыл. Хотя использование пересадки эмбрионов в коммерческих программах разведения лошадей бывает затруднено из-за необходимости обеспечения подходящих кобыл-реципиентов на участке сбора эмбрионов или кобыл-доноров в централизованной лаборатории по пересадке эмбрионов, разработка методов, обеспечивающих кратковременное хранение и транспортировку эмбрионов устраняет необходимость наличия реципиентов на участке. Поскольку материалы, необходимые для сбора и транспортировки эмбриона, хорошо подходят для полевых условий, эти новые методы позволяют большему числу ветеринаров осуществлять пересадку эмбрионов для своих клиентов, желающих воспользоваться данным методом.

Хотя пересадка эмбрионов позволяет зажеребеть некоторым кобылам, которые без этого не смогли бы родить жеребенка, некоторые кобылы не в состоянии предоставить эмбрионы для пересадки. Пересадка эмбриона не помогает кобылам с нарушением овуляции, хроническим эндометритом и анатомическими нарушениями (например, цервикальными спайками). Однако этих кобыл можно использовать в качестве доноров ооцитов и продолжать производить жеребят с использованием современных репродуктивных методов искусственного оплодотворения, таких, как пересадка ооцитов, оплодотворение in vitro и введение спермы в цитоплазму. В настоящее время исследуется применение данных методов у лошадей, и они будут рассмотрены в других главах данного издания.