Глава 5.21
Пересадка ооцитов
ЭЛЕН М. КАРНЕВЕЙЛ
Форт Коллинз, Колорадо
Пересадка ооцитов заключается в введении ооцитов кобылы-донора в фаллопиеву трубу кобылы-реципиента. Ооциты могут размещаться внутри матки или внутри фаллопиевой трубы. Размещение ооцитов и спермы внутри фаллопиевых труб реципиента более точно называют пересадкой гамет в фаллопиевы трубы (гамета – половая клетка – прим. перев.) (GIFT).
Первая успешная пересадка ооцитов была произведена в 1989 году; однако, данный метод начали применять на коммерческой основе только в конце 1990-х годов. В настоящее время пересадка ооцитов применяется для получения жеребят от кобыл с недостаточной фертильностью, которым не помогает пересадка эмбрионов из-за различных заболеваний половых органов. К таким заболеваниям относятся нарушение овуляции, закупорка фаллопиевых труб, рецидивирующие или тяжелые маточные инфекции, а также разрывы или рубцы на шейке матки. В некоторых случаях причину нарушения репродуктивной функции невозможно диагностировать; однако, пересадка ооцитов в этом случае может дать успешный результат.
СИНХРОНИЗАЦИЯ ДОНОРОВ И РЕЦИПИЕНТОВ
Сбор ооцитов производится из преовуляторных фолликулов в период между 24 и 36 часами после введения человеческого хорионического гонадотропина (hCG); 1500-2500 МЕ (в/в) кобыле-донору или в период между 0 и 14 часами до предполагаемой овуляции. hCG вводится в следующих случаях:
Фолликулы имеют диаметр более 35 мм.
Ослабленный тонус матки и шейки матки.
Отек матки или эстральное поведение в течение 2 и более дней.
Некоторым кобылам, в особенности кобылам старшего возраста, не всегда помогает введение hCG. В таких случаях автор данной статьи использует сочетание аналога гонадотропного рилизинг-гормона (GnRH) деслорелина ацетата (2,1 мг в виде имплантата; Овуплант), после чего через 4-5 часов производится инъекция hCG (2000 МЕ в/в).
Через 36 часов после введения hCG донору производится немедленная пересадка ооцитов в фаллопиеву трубу реципиента. Перед пересадкой ооцитов через 24 часа после введения препарата донору производится сбор ооцитов и их посев in vitro на 12-16 часов. Преимуществом сбора ооцитов в период между 32-36 часами после введения донору hCG заключается в том, что при этом не требуется посева ооцитов in vitro. Однако у кобыл-доноров овуляция фолликулов может наступить до сбора ооцитов. Сбор и посев ооцитов через 24 часа после введения hCG донору часто легче спланировать; можно собрать ооциты днем и произвести их пересадку на следующее утро. Однако для данного метода необходимо дорогостоящее оборудование и обучение персонала взятию тканей на посев. При измененном методе сбор ооцитов производится через 24 часа после введения hCG и немедленная пересадка их в фаллопиеву трубу реципиента, чтобы созревание закончилось внутри фаллопиевой трубы. При этом последнем методе осеменение реципиентов производится через 16 часов после пересадки ооцитов.
СБОР ООЦИТОВ
Сбор ооцитов обычно производится при помощи одного из двух методов. В одном методе яичник прижимают через прямую кишку к той же стороне кобылы, и производится кожная пункция, а троакар перемещается в брюшную полость. Яичник прижимают к концу троакара, а в это время иглу продвигают через троакар в полость фолликула.
В лаборатории автора сбор ооцитов производится путем трансвагинальной аспирации фолликулов под контролем ультразвука. Для этой процедуры используется линейный или ультразвуковой преобразователь с линейным и криволинейным датчиком, помещенным в футляр с игольным стержнем. Перед данной процедурой удаляют содержимое прямой кишки и очищают область наружных половых органов. Кобыле вводят седативные препараты (ксилазин гидрохлорид, 0,4 мг/кг и буторфанол тартрат, 0,01 мг/кг в/в) и какой-нибудь препарат для расслабления прямой кишки (пропантелин бромид, 0,04 мг/кг в/в). Применяется сдерживание кобылы. Датчик покрывают нетоксической мазью и помещают в передний отдел влагалища латерально по отношению к заднему отделу шейки матки и с той же стороны, где будет производиться аспирация фолликула. Фолликул фиксируют через прямую кишку и стабилизируют верхушку фолликула рядом с игольным стержнем. Иглу продвигают через игольный стержень и производят пункцию вагинальных и фолликулярных стенок. В лаборатории автора данной статьи используется двухполостная игла 12 размера (Cook Veterinary Products), Спенсер, Индиана). Фолликулярную жидкость аспирируют из фолликула при помощи специального насоса под давлением -150 мм рт. ст. После удаления фолликулярной жидкости полость фолликула промывают 50-100 мл раствора (обычно модифицированным фосфатно-буферным раствором Дулбекко или Эмкар [IVP, Окленд, Новая Зеландия]), который содержит сыворотку зародыша теленка (1 %) или бычий сывороточный альбумин (0,4 %) и гепарин (10 МЕ/мл).
Оборудование, используемое для пересадки ооцитов, подогревают перед применением до 38,5º С, поскольку ооциты чувствительны к изменениям температуры. После сбора фолликулярный аспират и промывную жидкость наливают в большие чашки и исследуют под препаровальной лупой для обнаружения ооцитов. Аспираты преовуляторных фолликулов часто содержат кровь, поскольку по мере приближения овуляции кровоснабжение фолликулов увеличивается. Ооциты имеют диаметр около 100 мкм и окружены большим количеством материнских клеток – скоплением клеток или лучистым венцом, имеющим вид кольца вокруг ооцита. После созревания ооцитов скопление клеток становится менее отчетливым. Лучистый венец четко выделяется в кровянистом промывном растворе и может быть виден невооруженным глазом.
ИССЛЕДОВАНИЕ И ПОСЕВ ООЦИТОВ
После сбора комплексы скоплений ооцитов (СОС) исследуются на расширение скоплений (которые бывает от компактных до полностью расширенных) и на признаки атрезии. Ооциты находятся в стадии атрезии, если СОС скученные и/или рассеяны. Лучистый венец полностью расширен, и цитоплазма яйцеклетки сморщена и имеет темный или пятнистый цвет. Ооциты с полностью расширенным скоплением (заметное отделение скопления клеток c расширением лучистого венца) считаются созревшими и пересаживаются как можно скорее в фаллопиевы трубы реципиента. Ооциты с умеренно расширенным комплексом скоплений (прозрачные СОС с умеренным разделением клеток скоплений и неполным расширением лучистого венца) перед пересадкой берутся на посев. Иногда кобыла-донор не реагирует на введение hCG, и фолликул не созревает. Таким образом, зернистые клетки яичника, выстилающие фолликулы, скапливаются в небольшие слои, и часто ооцит невозможно извлечь. При сборе незрелых ооцитов (компактные СОС с маленькими или неразделенными скоплениями клеток) посев должен производиться в специальных условиях, в том числе с добавлением в среду для созревания ооцитов гормонов и факторов роста.
После обнаружения и исследования ооциты промывают и помещают в питательную среду для пересадки или сбора. Обычно для посева созревающих ооцитов используется среда для посева тканей (TCM) 199 с добавлением 10 % сыворотки зародыша теленка, 0,2 мМ пирувата и 25 мг/мл гентамицина сульфата. Для поддержания соответствующей температуры для посева 38,5º С используется инкубатор с углекислым газом (СО2), заполненный воздухом с 5 % или 6 % содержанием СО2.
ПЕРЕСАДКА ООЦИТОВ
Пересадка ооцитов производится молодым кобылам (желательно 4-10 лет) с нормальным состоянием репродуктивной системы. Ооциты пересаживают хирургическим путем; поэтому для облегчения пересадки важную роль играет достаточное воздействие на яичник. Кобылы с короткими толстыми боками и короткими широкими связками не очень подходят в качестве реципиентов. В качестве реципиентов ооцитов используются кобылы в период цикла и без него. При использовании кобыл в период цикла он должен быть синхронизирован с циклом донора; таким образом, hCG вводится донору в период течки и реципиенту в то же время дня. Перед использованием кобылы в качестве подходящего реципиента производится аспирация ее собственного ооцита. Кобылы в период анэструса и раннего перехода при отсутствии цикла подходят в качестве реципиентов. В период сезона спаривания высокую дозу аналога GnRH или инъекции прогестерона и эстрогена (150 мг прогестерона и 10 мг эстрадиола) вводят для уменьшения развития фолликулов у потенциальных реципиентов. Перед пересадкой реципиентам с отсутствием цикла вводят эстрадиол (2-5 мг ежедневно в течение 3-7 дней), а после пересадки прогестерон (150-200 мг ежедневно). У кобыл с отсутствием эстрального цикла беременность нужно поддерживать при помощи экзогенного прогестерона.
Пересадка ооцитов производится посредством боковой лапаротомии лошадям в положении стоя под действием седативных препаратов. Реципиентов прислоняют к опоре и перед операцией вводят седативные средства (ксилазин гидрохлорид, 0,3 мг/кг и буторфанол тартрат, 0,01 мг/кг в/в). На операционном поле выстригают шерсть, очищают его от грязи и протирают 2 % раствором лидокаина. Непосредственно перед операцией применяются дополнительные седативные средства (детомидин гидрохлорид 9 мг/кг и буторфанол тартрат 0,01 мг/кг в/в). Примерно посередине между последним ребром и выступом тазобедренного сустава делают разрез в коже, а мышечные слои разделяют с помощью сетки. Яичник и фаллопиеву трубу выводят через разрез наружу. Ооцит проталкивают в оплавленную стеклянную пипетку, и пипетку осторожно проводят в воронкообразное отверстие фаллопиевой трубы и продвигают примерно на 3 см. Пересадка ооцита производится по крайней мере менее чем с 0,05 мл среды.
ОСЕМЕНЕНИЕ РЕЦИПИЕНТОВ
В коммерческих программах по пересадке ооцитов используются жеребцы с хорошей фертильностью. Часто используется охлажденная и транспортируемая сперма. При использовании в различных экспериментах свежей спермы от фертильных жеребцов и ооцитов от молодых кобыл осеменение реципиента лишь за 12 часов или всего лишь через 2 часа после пересадки ооцитов привело к частоте возникновения беременностей у 82 % кобыл (в 9 из 11 случаев осеменения) и 57 % (8 из 14 случаев) соответственно. В коммерческих программах по пересадке ооцитов участвовали кобылы старшего возраста с нарушением репродуктивной функции и использовалась охлажденная сперма многих жеребцов с различной фертильностью. Частота возникновения беременностей при осеменении реципиентов до или и до и после пересадки ооцитов была значительно выше, чем в тех случаях, когда осеменение реципиентов производилось после пересадки (18 из 45, 40 %; 27 из 53; 51 % и 0 из 10 соответственно). Полученные результаты показывают, что перед пересадкой ооцита достаточно провести осеменение реципиента спермой с (5 х 108 – 1 х 109) прогрессивно подвижными сперматозоидами фертильного жеребца. Однако при недостаточной фертильности жеребца полезно осеменение реципиента до и после пересадки ооцита.
После осеменения и пересадки ооцита проводится ультразвуковая эхография матки реципиента для обнаружения внутриматочной жидкости. Реакция матки на осеменение часто бывает более сильной при осеменении реципиентов после пересадки, чем при осеменении только до пересадки ооцитов. Исследование и лечение матки производится раз или два в день до исчезновения жидкости на ультразвуковом изображении. Реципиентов с накоплением внутриматочной жидкости лечат так же, как и кобыл с овуляцией, окситоцином или простагландинами для стимуляции сокращения матки или лаважем и инфузией матки.
ПЕРЕСАДКА ООЦИТОВ В БУДУЩЕМ
Было доказано, что пересадка ооцитов является ценным методом достижения жеребости у кобыл, которые не могут выносить собственного жеребенка или произвести эмбрион для пересадки. Поскольку для кобылы не требуется наступление овуляции или подходящая обстановка для оплодотворения или развития эмбриона, необходим лишь донор ооцитов для получения преовуляторного фолликула с жизнеспособным ооцитом.
С успехом производилась пересадка ооцитов и небольшого количества сперматозоидов (200000 подвижных сперматозоидов) в фаллопиевы трубы реципиентов. Жеребость можно вызвать при помощи GIFT и ограниченном количестве сперматозоидов, например, у жеребцов с недостаточной фертильностью и при сперме, полученной у племенных жеребцов, или замороженной сперме.
Благодаря использованию данного метода в лаборатории автора недавно удалось вызвать жеребость от замороженных и затем оттаявших ооцитов и от ооцитов, взятых из удаленных и транспортированных яичников мертвых кобыл. Столь успешные современные методы позволяют сохранить генетический фонд дорогостоящих кобыл.