Ловушки радикалов или "липидные антиоксиданты": a-токоферол (сверху) и ионол (снизу)

3. Соединения, связывающие железо. Большинство из них, включая такие природные соединения как дипептид карнозин, не просто связывают железо, но, самое главное, не дают ему возможности приникнуть в липидную фазу мембран, поскольку образующиеся комплексы, в силу своей полярности, не проникают в гидрофобную зону. Для детоксикации двухвалентного железа в организме существует, по-видимому, целая система окисления и связывания ионов железа. В плазме крови эта система представлена ферментом церрулоплазмином (феррооксидазой), который окисляет Fe²⁺ до Fe³⁺ кислородом без образования свободных радикалов, и белком трансферрином, который связывает и переносит в кровяном русле ионы трехвалентного железа, которые затем захватывается клетками. В клетках железо может восстанавливаться аскорбиновой кислотой и другими восстановителями, но затем окисляется и депонируется в окисленной форме внутри ферментного белкового комплекса ферритина.

МЕТОД ЭЛЕКТРОННОГО-ПАРАМАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА (ЭПР)

Самый прямой метод изучения свободных радикалов – метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). По наличию, амплитуде и форме сигналов (спектров) ЭПР можно судить о существовании непарных электронов в образце, определять их концентрацию, а иногда и выяснить, какова химическая структура радикалов, которые эти непарные электроны содержат. К прямым методам изучения радикалов можно отнести также метод хемилюминесценции (ХЛ). При взаимодействии радикалов друг с другом выделяется много энергии, которая в некоторых случаях испускается в виде фотонов (квантов света). Интенсивность такого свечения (ХЛ) пропорциональна скорости реакции, в которой участвуют радикалы и, следовательно – их концентрации. Надо отметить, что при всех достоинствах этих методов, в особенности метода ЭПР, их чувствительности оказывается зачастую недостаточной. В биологических системах скорости образования радикалов кислорода или липидных радикалов в мембранах не так уж велики, зато очень велики скорости исчезновения этих радикалов; поэтому концентрация радикалов в каждый данный момент времени (так называемая стационарная концентрация) зачастую так мала, что обнаружить их непосредственно методом ЭПР невозможно. Выход из положения заключается в том, что активные радикалы переводятся в неактивные, стабильные, которые регистрируются с помощью ЭПР. С этой целью к изучаемому образцу (например, к суспензии клеток, гомогенату ткани или раствору, где протекают реакции с участием свободных радикалов) добавляют особые вещества, называемые спиновыми ловушками (хотя "ловят" они, конечно не спины, а радикалы). Например, для "улавливания" радикалов гидроксила HO· используют фенилбутилнитрон (ФБН). При взаимодействии ловушки с радикалом происходит присоединение радикала к ловушке с образованием нового, стабильного радикала, получившего название "спинового аддукта" (от английского слова add – добавлять, складывать). Сигналы ЭПР спиновых аддуктов разных радикалов слегка различаются по форме. Это позволяет идентифицировать радикалы, образующиеся в изучаемой системе. Для улавливания других радикалов (скажем, супероксида) используют другие ловушки. Поскольку спиновая ловушка "перехватывает" свободные радикалы, она тормозит (ингибирует) тот процесс, который этими радикалами вызывается, например, уменьшает повреждение живых клеток радикалами HO·. Таким образом, спиновые ловушки используются в двух целях: чтобы выяснить, какие радикалы образуются и какие процессы в клетке они вызывают.

ПРИНЦИП ЭПР

Спектроскопия магнитного резонанса отличается от других видов спектроскопии тем, что расщепление энергетических уровней существует только в присутствии магнитного поля. Для обычно достижимых в лабо­раторных условиях магнитных полей переходы между уровнями энергии ядер, являющихся магнитными диполями, наблюдаются в радиочастот­ной области, а переходы между уровнями энергии спинов неспаренных электронов — в микроволновой области. Эти спектроскопические методы — ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и электронный парамаг­нитный резонанс (ЭПР) дают богатую структурную информацию, что делает их незаменимыми в химии.

МАГНИТНАЯ ВОСПРИИМЧИВОСТЬ

Если вещество поместить в магнитное поле напряженностью Н, то плотность магнитного потока В внутри него определяется выражением

В=Н+4πМ,

где М — намагниченность вещества.

Простейшим магнитом является магнитный диполь. Магнитные ди-польные моменты представляют собой векторы и обозначаются через µ, их абсолютные величины обозначаются как µ,. Магнитный диполь — это маленький магнит. Его можно упрощенно представить себе как малень­кий круговой ток. Электрон и многие ядра — магнитные диполи.

Намагниченность образца М определяется как магнитный момент единицы объема и может быть записана как

,

где п — число магнитных диполей в единице объема и —значение ди-польного момента в направлении магнитного поля Н, усредненное по всем элементарным магнитным диполям.

В противоположность поляризации электрическим полем магнитный момент может быть ориентирован как в направлении прило­женного поля, так и в противоположном ему направ­лении. Вещества, для которых намагниченность на­правлена по полю, называют парамагнетиками, а вещества, для которых намагниченность противоположна полю, — диамагнетиками.

Парамагнетизм является результатом ориентации постоянных маг­нитных диполей в образце. Постоянные магнитные диполи обусловлены или спинами неспаренных электронов, или угловыми моментами элек­тронов на атомных или молекулярных орбиталях. Электроны на орби-талях с 1= 1, 2, 3 ... имеют угловой момент и поэтому обладают магнит­ным моментом. Ядра с магнитными моментами также характеризуются парамагнитными свойствами. Однако ядерный парамагнетизм состав­ляет только одну миллионную долю парамагнетизма, обусловленного орбитальными моментами или спинами неспаренных электронов. Маг­нитные свойства ядер исследуют методом ядерного магнитного резонанса.

В отсутствие магнитного поля магнитные диполи, обусловливающие парамагнетизм, ориентированы в пространстве случайным образом. При наличии поля происходит ориентация постоянных магнитных дипо­лей в направлении приложенного поля, который так же, как и в случае выстраивания электрических диполей, электрическим полем, препятст­вует тепловое движение.

В большинстве веществ магнитные эффекты, обусловленные элект­ронными спинами или движением электронов на орбиталях, не прояв­ляются, поскольку электроны в заполненных оболочках спарены. Мно­гие ионы редкоземельных элементов парамагнитны, так как имеют неспаренные электроны. Свободные радикалы обладают нечетным чис­лом электронов и поэтому также являются парамагнетиками.

ПРИНЦИП ЭПР

Если поместить электрон в магнитное поле, то он приобретает энергию Е_магн, которая пропорциональна - магнитному дипольному моменту электрона в направлении поля:

Где В- напряженность магнитного поля. Определяя проэкцию магнитного момента на ось z получаем основное уравнение ЭПР

гдеg_e — электронный g-фактор , —магнетон Бора иm_s — квантовое число, определяющее z-компоненту спина электрона. Уровни энергии электрона в магнитном поле приведены на рисунке. Поскольку электрон имеет отрицательный заряд, его магнитный момент направлен противопо­ложно спиновому моменту, и электронное спиновое квантовое число равно— для нижнего уровня. Этот же рисунок показывает, что энергия перехода с уровняm_s= на уровеньm_s= дается выражением

СВЕРХТОНКОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ

Метод ЭПР особенно полезен в химических исследованиях благода­ря тому, что электронный магнитный момент взаимодействует с другими магнитными моментами в молекуле, включая протоны и другие ядра. Наблюдающееся при этом расщепление линий поглощения называется сверхтонким расщеплением.

В качестве простого примера сверхтонкого расщепления рассмотрим свободный радикал с двумя протонами, в различной степени влияющи­ми на электронные уровни энергии в магнитном поле. На рисунке пока­зано влияние двух протонов на возможные уровни энергии электрона. В присутствии магнитного поля неспаренный электрон имеет два уровня энергии m_s= иm_s= .

Два протона расщепляют эти уровни так, что в результате неспаренный электрон имеет восемь уровней энергии. В электронном парамагнитном резонансе происходит переворачивание электронного спина, однако направление ядреных спинов не изменяет­ся. Таким образом, в ЭПР электрон, поглощая энергию, переходит с энергетического состояния в нижней группе (m_s= ) на соответству­ющий уровень в верхней группе (m_s= ). При увеличении напряженности магнитного поля последовательно выполняются условия резонанса для четырех переходов. Соответственно наблюдаются четыре линии в ЭПР-спектре. Поскольку четыре ядерно-спиновых состояния равновероятны, эти четыре линии имеют одинаковую интенсивность.

Если два протона характеризуются одинаковой постоянной взаимо­действия с неспаренным электроном, спектр имеет три линии, причем центральная линия вдвое интенсивнее, поскольку, как это показано на рисунке, она соответствует двум возможным переходам. Два или бо­лее протонов, одинаково взаимодействующие с неспаренным электроном, называются эквивалентными.

Следующий рисунок иллюстрирует сверхтонкое расщепление для случаев неэквивалентных и эквивалентных протонов. Возникающую картину можно представить так: первый протон расщепляет линию ЭПР на две компоненты, а взаимодействие со вторым протоном приводит к дальнейшему расщепле­нию двух линий на квадруплет. Когда два сверхтонких расщепления раз­личны, возникают четыре линии поглощения. Если оба сверхтонких рас­щепления одинаковы, т.е. протоны эквивалентны, получаются три линии.

Сверхтонкое расщепление, обусловленное двумя неэквивалентными (а) и двумя эквивалентными (б) протонами.

ПРИНЦИП УСТАНОВКИ И БЛОК СХЕМА ЭПР-СПЕКТРОМЕТРА ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ

ПРИНЦИП УСТАНОВКИ И БЛОК СХЕМА ЭПР-СПЕКТРОМЕТРА ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ

ЭПР-спектрометр состоит из магнита, создающего постоянное маг­нитное поле, которое расщепляет энергетические уровни, микроволнового (СВЧ, ν=10 ГГц,λ=3 см) генератора для возбуждения переходов и детектора для регистра­ции испущенного излучения. Разрешающая способность ЭПР-спектрометра зависит от силы и однородности магнитного поля и постоянства радиочастоты. Для большинства химических исследований необходимо высокое разрешение.

Для получения спектров высокого разрешения обычно используют магнитные поля напряженностью порядка 3-4 кГс.

Исследуемый обра­зец¹ помещен в трубку между полюсами электромагнита. Постоянное магнитное поле В направлено по оси z. Напряженность этого магнитно­го поля несколько меньше значения, необходимого для резонанса. Точная настройка на резонанс достигается при помощи дополнительных элект­ромагнитов, установленных на полюсах основного магнита. Обмотки этих электромагнитов питаются от генератора качающейся частоты, так что напряженность магнитного поля в образце изменяется, проходя через резонанс. Генератор качающейся частоты дает линейно нарастаю­щее напряжение, которое при достижении определенного значения па­дает до нуля, а затем снова возрастает Микроволновое излучение от клистрона проходит по волноводу в полый резонатор с об­разцом. В условиях, когда в образце имеют место переходы между элек­тронными спиновыми уровнями, энергия микроволнового излучения по­глощается и на кристаллический детектор попадает меньше энергии. Импульсами генератора ка­чающейся частоты также запускается развертка осциллографа или са­мописца.

Ис­пользование фазочувствительного детектора позволяет получать на осциллографе или самописце производную линии поглощения. Форма кривой производной линии поглощения изображена на ниже лежащем рисунке.

СИГНАЛ ЭПР. ЕГО ЭЛЕМЕНТЫ И ИХ МАТЕМАТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ.

Сигнал ЭПР

В результате усиления сигнала ЭПР (путем его модуляции) мы получаем не поглощение A, а - первую производную поглощения по полю dA/dH.

Основные характеристики сигнала ЭПР

1. Амплитуда сигнала ЭПР

2. Ширина сигнала ЭПР

3. g-фактор

ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ЭПР

МЕТОД СПИНОВЫХ ЗОНДОВ

Основная идея метода состоит в присоединении к той или иной функциональной группе белка свободного радикала и изучению харак­теристик его сигналов ЭПР. Наиболее удобны в этом отношении нитроксильные радикалы, содержащие свободнорадикальную группу N-О:

Спектр ЭПР нитроксильных радикалов состоит, в простейшем случае, из трех линий равной интенсивности, благодаря взаимодействию неспаренного электрона с ядром атома азота, имеющим целочисленный спин, равный ±1 или 0.

1. Cпектр ЭПР ТЕМПО при разных tс

Время корреляции нитроксильного радикала непосредственно связано с микровязкостью среды

Используя уравнение Стокса-Эйнштейна можно определить значение вязкости в соответствующей макроскопической системе

где R - эффективный радиус нитроксильного радикала.

T – абсолютная температура

 - время корреляции

 - вязкость

Из уравнения видно, что используя нитроксильный радикал в качестве зонда, можно определить микровязкость среды, в которой находится радикал. В биологических исследованиях этот прием широко используется для измерения микровязкости биологических мембран.

2. Параметр гидрофобности f

3. Параметр упорядоченности и вязкость мембраны

4. Cпектр ЭПР рН чувствительного зонда (pK=4,7) при разных рН

МЕТОД СПИНОВЫХ ЛОВУШЕК

СПИНОВЫХ ЛОВУШЕК МЕТОД, метод определения по спектрам электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) короткоживущих радикалов после их присоединения к подходящим акцепторам-спиновым ловушкам. Последние специально добавляют в реакц. смесь, где они реагируют с радикалами R^•, образующимися в ходе изучаемых гомо-литич. процессов. Продукт их взаимод.-спин-аддукты-достаточно стабильные радикалы, к-рые можно исследовать методом ЭПР в широком температурном интервале. Спиновыми ловушками служат гл. обр. нитрозосоединения (обычно третичные или ароматические) и нитроны, к-рые образуют нитроксильные радикалы (р-ции 1 и 2) или ами-нильные радикалы (р-ция 3):

Спектры ЭПР спин-аддуктов характеризуются триплетным сигналом, возникающим в результате взаимод. неспаренного электрона с ядром ¹⁴N. В зависимости от заместителей при атоме N константа сверхтонкого взаимод. a_N для разл. нитроксилов изменяется в довольно широких пределах: от 0,4-0,5 мТл (в случае диацилнитроксилов) до 2,4-2,8 мТл (в случае алкоксиалкилнитроксилов). Поэтому значения a_N для разл. спин-аддуктов могут дать информацию о природе короткоживущего радикала. Кроме того, если в a- и b-поло-жениях к атому N находятся ядра с отличным от нуля спином, то в спектре ЭПР спин-аддукта наблюдается дополнит. расщепление линий осн. триплета благодаря взаимод. неспаренного электрона с этими ядрами.

Большой выбор спиновых ловушек с известными значениями констант скоростей присоединения к ним разл. радикалов с неспаренными электронами на атомах углерода, кислорода, металла или др. элемента позволяет целенаправленно применять спектроскопию ЭПР для детектирования промежут. парамагнитных частиц в гомолитич. процессах и получать количеств. данные об элементарных стадиях этих процессов в разл. фазах. Поскольку спин-аддукты ряда радикалов весьма стабильны, их можно накапливать в ходе свободнорадикальных р-ций. в т. ч. таких, к-рые протекают в живых организмах.

• Концентрация свободных радикалов в клетках и тканях не превышает 10 нМ.

• Минимальная концентрация свободных радикалов, которую можно обнаружить методом ЭПР 100 нМ

Основные требования к спиновым ловушкам

• Быстрые реакции с радикалами

• Отсутствие побочных реакций

• Образование стабильных аддуктов

• Отличие в параметрах спектра ЭПР спиновых аддуктов у разных радикалов

ФОН ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ПОЛЯ ЗЕМЛИ.