1.3. Активация тромбоцитов. Морфология тромбоцитов

Тромбоциты, син.кровяные пластинки (устар), – форменные элементы крови, небольшие (0,5-3,0мкм), дисковидные, безъядерные клетки ( РИС 11а ), образуются из цитоплазмы крупных (2—50мкм) костномозговых клеток– мегакариоцитов. Гемопоэтический цитокин тромбопоэтин стимулирует развитие мегакариоцитов и образование тромбоцитов. Мегакариоциты происходящие из коммитированной (т.е. ориентированной на одном из ростков кроветворения (например, мегакариоцитарном) стволовой клетки костного мозга, порождают и “отшнуровывают” тромбоциты в соответствии со сложной, во многом еще не ясной, многоступенчатой программой созревания. Этот процесс приводит к трансформации мегакариоцитов в паукообразные клетки с множеством нитевидных отростков, в которых формируются утолщения так называемые протромбоциты и созревают тромбоциты (Рис 11б).

Образование тромбоцитов

Стволовая клетка

(детерминированная к миелопоэзу)

Мегакриобласт

Промегакариоцит

Мегакариоцит

Паукообразные клетки

(с отростками

протромбоцитами)

Тромбоциты

Рис 11

Организация тромбоцита начинается с агрегации микротрубочек протромбоцитов в закрученные, замкнутые пучки, определяющие дисковидную форму будущего тромбоцита, и создания мембранного скелета из нитей актина и спектрина. Дисковидная форма стабилизируется связью нитей актина с филамином А и рецептором фактора фон Виллебранда – ГП Ib.( РИС 11 фох). Затем в протромбоциты доставляются специфические внутриклеточные компоненты. Освобождение созревших тромбоцитов из концевых участков протромбоцитов обеспечивается дифференцировкой микротрубочек. Процесс отшнуровки тромбоцитов с помощью мотора - белков микротрубочек, подтверждается присутствием в крови небольшого процента (< 5%) клеток, подобных гантелям ( РИС 11в ). Время жизни тромбоцитов 7-10 дней.

Тромбоциты содержат множество гранул: α- гранулы, плотные гранулы, лизосомы, а так же органеллы: митохондрии, аппарат Гольджи (Рис 12(5). Цитоскелет тромбоцита отвечает за изменение формы клетки, секрецию и ретракцию сгустка. Он формируется субмембранными филаментами актина, пучками микротрубочек, а также плотной тубулярной системой, которая образуется из эндоплазматического ретикулума мегакариоцита, и системой открытых каналов,так называемой открытой канальцевой или каналикулярной системой. Клетки секретируют содержимое гранул через систему открытых каналов, которые сообщаются друг с другом и внешней средой и создают широкую поверхность для экзоцитоза и для взаимодействия мембранных рецепторов с агонистами. При связывании агониста, называемого индуктором, с рецептором на мембране клетки происходит активация тромбоцитов.

Индукторы агрегации

Индукторы делят на два типа: слабые: АДФ (в низких концентрациях), адреналин, серотонин, которые вызывают обратимую агрегацию, и сильные: тромбин, коллаген, АДФ (в высоких концентрациях), тромбоксан А₂, фактор, активирующий тромбоциты, которые стимулируют необратимую агрегацию. Под действием индукторов секретируются следующие компоненты: из плотных гранул: АДФ, АТФ, серотонин, кальций; из α-гранул: адгезивные белки (фактор фон Виллебранда(vWF), Р-селектин (PS),фибриноген, фибронектин, тромбоспондин),

мембранные ГП

и рецепторы ( GPIb, αIIbβ3, ανβ3, PECAM-1, CD40L, ТФ), факторы и ингибиторы

свертывания (факторы: V/Va, VIII, XI, ингибиторы: TFPI, AT),

компоненты фибринолиза

( плазминоген(Plg), активатор Plg – u-PA, ингибиторы фибринолиза: PAI-1, α2- антиплазмин, α2-макроглобулин, TAFI),

факторы роста, цитокины, хемокины (PDGF,EGF,VEGF, bFGF, MIP-1, TGF-β1,-2, IL-1β, IL-8,RANTES

)

,основные белки

(тромбоцитарный фактор 4(PF4), бета-тромбоглобулин(β-TG),эндостатины)

; из лизосом (только под действием сильных индукторов): кислые гидролазы (Рис 13(8).

Обратимая и необратимая агрегация

Активация тромбоцитов ведет к клеточным ответам, формально различным, но на самом деле неразрывно связанным друг с другом : 1) морфологическим: структурным изменениям, ведущим к формированию тромбоцитарной пробки; и 2) биохимическим: освобождению и синтезу специфических компонентов.

Под действием индукторов активированные тромбоциты изменяют форму от дисковидной до сферической; образуют псевдоподии, объединяются в рыхлые агрегаты( Рис 11с) Затем следует секреция содержимого гранул во внешнюю среду через каналикулярную систему. При действии тромбина на тромбоциты уже через 5 секунд после стимуляции происходит изменение формы клетки, централизация гранул, секреция их содержимого в систему открытых каналов и далее во внеклеточную среду. Сложная система сократительных белков участвует в сохранении формы клетки, главные из которых - актин, миозин, тропонин, актин-связывающий белок, система микротрубочек. Все эти белки участвуют в реализации действия индуктора.

Активация тромбоцитов коллагеном

Действие агонистов на тромбоциты осуществляется через специфичесие рецепторы (Таблица 1). Коллаген субэндотелия служит эффективным субстратом связывания тромбоцитов к поврежденному участку сосуда и активатором клеток, поддерживая их стабильную адгезию, активацию и рост тромба через два основных рецептора – ГПVI и интегрин 21 ( ГП IaIIa)(Рис 14).

ГП VI – член Ig суперсемейства. Связывание коллагена с ГП VI тромбоцитов ведет к кластеризации и последующему фосфорилированию (по ITAM доменам) FcR -цепей (ассоциированных с рецептором) Srk киназами ( Fyn и Lyn) . Последние вызывают активацию Syk киназы, которая, в свою очередь, фосфорилирует адапторные белки LAT и SLP-76. В конце концов сигнальный каскад ведет к фосфорилированию и активации PLC2, повышению концентрации внутриклеточного кальция, активации PKC освобождению ADP и промотированию эффективной активации тромбоцитов.

Активация коллагеном рецептора ГП VI может “сдвигать” интегрины 21 и IIb3 из низкоаффинного в высокоаффинное состояние, приводя к активации тромбоцитов и стабильному прикреплению клеток к поврежденной стенке сосуда.

Адгезия тромбоцитов к коллагену через интегрин 21 также стимулирует внутриклеточную сигнализацию, которая ведет к активации Srk киназ, PLC2 , повышению концентрации внутриклеточного кальция ( [Ca ²⁺]_i ) . Эта реакция приводит к стабилизации адгезии, распластыванию тромбоцитов, их активации и экспозиции на поверхность тромбоцита интегрина IIb3. Интегрин IIb3 через мостики фибриногена рекрутирует еще не адгезированные тромбоциты.

За адгезией и активацией тромбоцитов адгезивными белками следует стадия агрегации активированных тромбоцитов , стимулируемая освобождаемыми клетками или вновь синтезированными индукторами агрегации, и создание активной поверхности для осуществления механизмов свертывания крови.

Активация тромбоцитов тромбином

Тромбин – трипсиноподобная сериновая протеиназа (КФ 3.4.21.5)- превращает фибриноген крови в фибрин ( см главу 2). В очень низких наномолярных концентрациях (которые на несколько порядков ниже тех, что необходимы для расщепления фибриногена) тромбин активирует тромбоциты через недавно обнаруженный специфический рецептор, называемый « рецептор, активируемый протеазой » (РАR). Взаимодействие тромбина с подтипом рецепторов –РАR1 промотирует агрегацию тромбоцитов, вызывает мультимеризацию ГПIb рецепторов, что повышает эффективность расщепления PAR1. ГП Ib служит кофактором PAR1.

Рецептор тромбина PAR1 относится к суперсемейству семидоменных рецепторов, сопряженных с разными подтипами ГТФ-связанных G-белков. В отличие от других членов суперсемейства рецептор тромбина расщепляется тромбином. Возникающий в результате гидролиза рецептора новый аминоконцевой пептид, так называемый “ привязанный лиганд” служит агонистом этого рецептора (см главу 3). Следующие основные биохимические реакции включаются в активацию тромбоцитов тромбином (Рис.15 (6). Взаимодействие агониста с рецептором на мембране клетки через определенный ГТФ-связывающий G_q белок ведет к активации фермента фосфолипазы С_β (ФЛС). Фосфолипаза С_β гидролизует фосфоинозитиды мембраны до двух вторичных посредников: водорастворимого инозитол(1,3,4)трифосфата (ИФ₃), вымывающегося в цитозоль и липофильного 1,2-диацилглицерина (ДАГ), который остается в мембране. ИФ₃ вызывает освобождение ионов кальция из плотной тубулярной системы и плазматической мембраны в цитозоль. ДАГ активирует протеинкиназу С, которая фосфорилирует белки. Ионы кальция взаимодействует с сократительными белками, микротрубочками. Происходит полимеризация актина, его взаимодействие с фосфорилированным миозином, изменяется форма клетки, образуются псевдоподии. Активированные тромбином тромбоциты секретируют содержимое гранул, синтезируют и освобождают агонисты агрегации, в том числе тромбоксан А_2.. Вследствие активации Са-зависимых протеаз происходит кластеризация рецепторов адгезивных белков, интегринов IIb3 ( ГПIIb/IIIa) в псевдоподиях, изменение их конформации и экспонирование на поверхности. Повышается текучесть мембраны, происходит перераспределение фосфолипидов таким образом, что на поверхности мембраны оказываются тромбогенные. Нарушается связь рецепторов с мембраной, происходит разрушение мембранного скелета, распластывание. Перестройка мембраны превращает ее в активный матрикс для связывания факторов свертывания крови, образования комплексов кофакторов и проферментов и их активации. На поверхность тромбоцитов мобилизуются Р-селектин и CD40лиганд, обеспечивающие стабилизацию агрегатов и их связывание с лейкоцитами и активированным эндотелием.

Синтез простагландинов

При повышении концентрации внутриклеточного кальция происходит активация еще одного мембранного фермента-фосфолипазы А₂ (ФЛА₂ ). ФЛА₂ освобождает из мембранных фосфолипидов (преимущественно фосфатидилхолина) арахидоновую кислоту (20-ти углеродная эйкозотетраеновую кислоту)(Рис15 (7). Фермент- циклооксигеназа(COX1), превращает арахидоновую кислоту в циклические эндоперекиси. Затем из эндоперекисей (простагландины ПГG₂ и ПГH₂) образуется целое семейство простагландинов. В тромбоцитах под действием фермента - тромбоксансинтазы образуется тромбоксан А₂ (TxА₂ ), а под действием липоксигеназы образуются лейкотриены, вовлекаемые в процессы свертывания крови и воспаления. Тромбоксан А₂ – мощный индуктор агрегации тромбоцитов и сильный вазоконстриктор. ТхА₂ освобождает кальций из плотной тубулярной системы. ТхА₂ быстро гидролизуется до тромбоксана В₂, лишенного активности. В клетках эндотелия находится фермент-простациклинсинтаза, который превращает циклические эндоперекиси в простациклин (простагландин ПГI₂), проявляющий сильную антиагрегационную и вазодилататорную активности. Простациклин -основной природный индуктор ингибирования агрегации, обусловленной рецептор-опосредованной активацией аденилатциклазы, повышением цАМФ и откачкой кальция из цитоплазмы в депо (Рис16 ( 8).

Известным ингибитором циклооксигеназы является ацетилсалициловая кислота (аспирин), которая в очень низких концентрациях блокирует только образование тромбоксана А₂ , не влияя на продукцию простациклина. В высоких концентрациях аспирин блокирует обе, зависимые от циклооксигеназы, реакции образования тромбоксана А₂ и простациклина.

Кроме цАМФ в контроле агрегации тромбоцитов участвует цГМФ. Повышение цГМФ наблюдается при действии на тромбоциты оксида азота, освобождаемого клетками эндотелия (также как фактора релаксации, происходящего из эндотелия). При действии на тромбоциты слабых индукторов агрегации, таких как низкие концентрации АДФ, адреналин, происходит обратимая агрегация, при которой за стадией агрегации следует дезагрегация, связанная с активацией аденилатциклазы, повышением цАМФ и поступлением кальция в депо.

Активация тромбоцитов АДФ

АДФ, освобождающийся из активированных клеток (плотных гранул тромбоцитов), взаимодействует со специфическими пуриновыми рецепторами на тромбоцитах и может вызывать обратимую и необратимую агрегацию в зависимости от концентрации агониста (Рис 17(12).

АДФ связывает два основных пуриновых рецептора на тромбоцитах - P2Y₁ и P2Y _12.

Активация небольшими концентрациями АДФ рецептора- P2Y₁, связанного с Gq-белком, ведет к повышению внутриклеточного Са²⁺ в реакции опосредованной PLCβ, изменению формы тромбоцита , экспонированию на поверхности интегринов IIb/3 и кратковременной агрегации.

Изменение дисковидной формы тромбоцита в сферическую, вытягивание псевдоподий и “складывание” мембраны – быстрый процесс, зависимый от мобилизации внутриклеточного кальция и активации Rho-киназы (p160ROCK).

АТР через рецептор P2X₁ открывает ионные каналы, отвечает за быстрый вход кальция в клетку и вносит вклад в изменение формы тромбоцита механизмом, не зависимым от активации рецептора P2Y₁ .(РИС!!!)

Итак, при действии небольших концентраций АДФ происходит обратимая агрегация, которая ведет к изменению формы клеток и экспонированию на поверхность интегринов IIb/3, связывающих фибриноген.

Необратимая агрегация, вызываемая более высокими концентрациями АДФ, приводит к реакции высвобождения. Эта реакция обеспечивается взаимодействием АДФ с другим членом семейства пуриновых рецепторов- P2Y ₁₂ (называемым также P2Y _adр.), связанным с белком Gi. Активация рецептора P2Y ₁₂ отвечает за ингибирование аденилатциклазы, снижение цАМФ и, как следствие, продолжительную агрегацию и секрецию (Рис16 ( 9).

Активация P2Y1 стимулирует первые этапы образования тромба, а активация P2Y12 способствует устойчивой активации тромбоцитов необходимой для образования стабильных тромбов.

Рецептор Р2Y₁₂ служит мишенью антитромботических лекарств, тинопиридинов ( тиклопедина и клопидогреля) — сильных и специфических ингибиторов АДФ-вызванной агрегации тромбоцитов.

Исходя из выше изложенного становится понятным, почему именно комбинационная терапия аспирином - блокатором циклооксигеназы тромбоцитов, препятствующим образованию ТХА2 (освобождаемого тромбином и другими сильными индукторами агрегации), и тиклопедином - блокирующим АДФ-вызванную агрегацию, является более результативной, чем монотерапия, для предотвращения тромбообразования при повреждении эндотелия (например, при атеротромбозе). Эти данные подтверждают критическую роль тромбоцитов в провокации тромбообразования.

Ингибирование агрегации тромбоцитов

Циркулирующие тромбоциты не адгезируют к нормальным эндотелиальным клеткам, которые имеют наряду с прокоагулянтными свойствами и антикоагулянтные, поскольку синтезируют и освобождают ингибиторы активации тромбоцитов. Важнейшими ингибиторами агрегации тромбоцитов являются – простациклин (PGI₂), оксид азота (NO) и АДФ- аза, расщепляющая агонист агрегации - АДФ (Таблица 2).Тромбомодулин, синтезируемый эндотелием и экспрессируемый на поверхность клеток, связывает тромбин, изменяет его специфичность таким образом, что фермент теряет способность активировать тромбоциты.В инактивации тромбина участвует гепаран сульфат- гепариноподобный гликозаминогликан эндотелия.

Не только повреждение эндотелия и экспонирование субэндотеля, компонентов экстрацеллюлярного матрикса вызывает адгезию и активацию тромбоцитов. При дисфункции эндотелия также создаются условия для адгезии тромбоцитов. Эндотелиальные клетки синтезируют и при их активации эксперессируют на поверхность целый ряд рецепторов адгезивных молекул: селектины Р( тромбоцитарный) и Е(эндотелиальный), интегрины(Таблица 1), клеточные адгезивные молекулы семейства иммуноглобулинов( ICAM(внутриклеточная адгезивная молекула)-1,VCAM и др), кадгерины. Кроме последних эти молекулы обнаружены и на мембране тромбоцитов. Уровень экспрессии этих рецепторов варьирует в зависимости от степени активации и дисфункции эндотелиальных клеток. Так, освобождаемый из телец Вейбела-Пейлейда вместе с фон Виллебранда фактором и экспрессируемый на поверхность эндотелия при его активации Р - селектин обеспечивает не только перекатывание (роллинг) лейкоцитов , но и связывание тромбоцитов и стабилизацию их агрегатов.Фибриноген крови, взаимодействуя с интегрином IIb3, может выполнять функции мостика не только между активированными тромбоцитами , но и тромбоцитами и эндотелием, связывая ICAM-1 эндотелия.

Тромбоцитарный тромб или пробка закрывает повреждения в стенке небольших сосудов. Тромбоциты также вносят существенный вклад в остановку кровотечения, формирование сгустка и тромба, создавая активную поверхность для свертывания крови и освобождая вазоконстрикторы ( серотонин, тромбоксан А₂ ), при повреждении крупных сосудов