35.Опсоно-фагоцитарная реакция

Стимулами для миграции нейтрофилов к местам повреждения служат вещества, освобождаемые разрушенными клетками крови и тканей. Нейтрофилы способны распознавать любые бактерии, проникшие в организм. Эту способность усиливают плазменные белки, называемые опсонинами, которые прикрепляются к поверхности бактерий и облегчают их узнавание. На этой способности нейтрофилов и опсонинов основаны методы расчетов интенсивности опсоно-фагоцитарной реакции.

Метод заключается на определении в условиях in vitro способности нейтрофилов периферической крови исследуемых животных (постановкой опсоно-фагоцитарной реакции - ОФР) фагировать (поглощать) микробные клетки. В качестве тест-культуры для ОФР используется чаще всего белый стафилококк - Staph. albus.

До сих пор у исследователей нет единой (унифицированной) терминологии относительно тех явлений фагоцитоза, которые они оценивают, а также и единого мнения о количестве тестов, оценивающих уровень фагоцитоза в организме животных.

О фагоцитарной способности лейкоцитов крови можно судить по данным их фагоцитарной активности, показателям общей фагоцитарной емкости, фагоцитарного числа и индекса, а также показателю завершенного фагоцитоза /2/.

Фагоцитарная активность выражается процентным отношением активных, участвовавших в фагоцитозе лейкоцитов к общему числу подсчитанных нейтрофильных лейкоцитов.

Ход работы: Для определения фагоцитарной активности лейкоцитов берется кровь (из ушных сосудов или при общих анализах из яремной вены) в количестве 0,1 мл, вносится в стерильную пробирку с 0,05 мл 2%-ного раствора лимоннокислого натрия (или гепарина) и осторожно смешивается. После этого в каждую пробирку со стабилизированной кровью вносится убитая при 70°С в течение 30 мин суточная двухмиллиардная культура определенного тест-микроба. В зависимости от цели исследования для постановки опыта могут быть использованы различные виды микроорганизмов. Наиболее часто при изучении состояния естественной резистентности используется культура золотистого или белого стафилококка того или иного штамма (209, 997 и др.).

Пробирку с приготовленной смесью осторожно встряхивают и ставят на 30 мин в водяную баню или термостат при температуре 37┘38°С. Через каждые 10 мин пробирки встряхивают, затем из крови готовят тонкие мазки. Их фиксируют метиловым спиртом и окрашивают методом Романовского-Гимза. При микроскопии мазка подсчитывают число фагоцитировавших лейкоцитов (чаще нейтрофилов, но можно также и других клеток - лимфоцитов, эозинофилов, моноцитов) из общего числа подсчитанных. Для получения достоверных результатов количество последних должно быть не менее 100.

Фагоцитарный индекс определяется средним числом фагоцитированных микробов, приходящихся на один активный лейкоцит. Фагоцитарный индекс характеризует интенсивность фагоцитоза. Для определения фагоцитарного индекса служат те же самые мазки, по которым определялась фагоцитарная активность лейкоцитов. В препаратах, приготовленных описанным выше способом, подсчитывают не менее 100 лейкоцитов и количество поглощенных ими микробных тел. Вычисляется фагоцитарный индекс путем деления числа фагоцитированных бактерий на число активных лейкоцитов.

Пример: При изучении мазка установлено, что из 100 просмотренных лейкоцитов в фагоцитозе приняло участие 80 лейкоцитарных клеток, которые фагоцитировали 400 микробных тел. Следовательно, фагоцитарный индекс равен 5 (400 : 80).

36.Иммуноферментный анализ, механизм, компоненты, применение. Иммуноферментный анализ или метод — выявление ан¬тигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции — интен¬сивность окраски прямо пропорциональна количеству свя¬завшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных бо¬лезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепати¬та В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекар¬ственных препаратов и других биологически активных ве¬ществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях (1010-1012 г/л).

Твердофазный ИФА — вариант теста, когда один из компо¬нентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или анти¬генов. При положительном результате изменяется цвет хромоге¬на. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем промывания,

I. При определении антител (левый рисунок) в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют сы¬воротку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, ме¬ченную ферментом, и субстрат/хромоген для фермента.

II. При определении антигена (правый рисунок) в лунки с сорби¬рованными антителами вносят антиген (напр., сыворотку кро¬ви с искомым антигеном), добавляют диагностическую сыво¬ротку против него и вторичные антитела (против диагностиче¬ской сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хро¬моген для фермента.

Конкурентный ИФА для определения антигенов: искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки.

Другой тест - Конкурентный ИФА для определения антител: искомые анти¬тела и меченные ферментом антитела конкурируют друг с дру¬гом за антигены, сорбированные на твердой фазе.

Иммуноблоттинг — высокочувстви¬тельный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Иммуноблоттинг ис¬пользуют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.

Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофоре¬за в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антиге¬нов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител боль¬ного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов челове¬ка, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.

37. Радиоиммунный анализ. Механизм. Практическое использование Радиоиммунный анализ (РИА) Высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген-антитело с применением антигенов или антител, меченных радионуклидом. После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике: интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.

Радиоиммунный анализ — метод количественного определения биологически активных веществ, (гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и др.) в биологических жидкостях, основанный на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами. Последними чаще всего являются специфические антитела. В связи с тем, что меченый антиген добавляют в определенном количестве, можно определить часть вещества, которая связалась с антителами, и часть, оставшуюся несвязанной в результате конкуренции с выявляемым немеченым антигеном. Исследование выполняют in vitro. Для Р. а. выпускают стандартные наборы реагентов, каждый из которых предназначен для определения концентрации какого-либо одного вещества. Исследование проводят в несколько этапов: смешивают биологический материал с реагентами, инкубируют смесь в течение нескольких часов, разделяют свободное и связанное радиоактивное вещество, осуществляют радиометрию проб, рассчитывают результаты. Метод отличается высокой чувствительностью, его можно использовать в диагностике заболеваний сердечно-сосудистой, эндокринный и других систем, для установления причин бесплодия, нарушения развития плода, в онкологии для определения маркеров опухолей и контроля за эффективностью лечения, для определения концентрации в крови иммуноглобулинов, ферментов и лекарственных веществ. В ряде случаев исследования выполняют на фоне нагрузочных функциональных проб (например, определение содержания инсулина в сыворотке крови на фоне пробы на толерантность к глюкозе) либо в динамике (например, определение в крови половых гормонов на протяжении менструального цикла).

38.Реакция пассивной гемагглютинации. Механизм, компоненты, применение Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использова¬нии эритроцитов (или латекса) с адсорбиро¬ванными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соот¬ветствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеива¬ние и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка.

Компоненты. Для постанов¬ки РНГА могут быть использованы эритроциты барана, лошади, кролика, курицы, мыши, человека и другие, которые заготавли¬вают впрок, обрабатывая формалином или глютаральдегидом. Ад¬сорбционная емкость эритроцитов увеличивается при обработке их растворами танина или хлорида хрома.

Антигенами в РНГА могут служить полисахаридные АГ микро¬организмов, экстракты бактериальных вакцин, АГ вирусов и риккетсий, а также другие вещества.

Эритроциты, сенсибилизированные АГ, называются эритроцитарными диагностикумами. Для приготовления эритроцитарного диагностикума чаще всего используют эритроциты барана, обла¬дающие высокой адсорбирующей активностью.

Применение. РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гор¬мона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительнос¬ти к лекарственным препаратам, гормонам и в некоторых других случаях.

Механизм. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) отличается значительно более высокой чувствительностью и специфич¬ностью, чем реакция агглютинации. Ее используют для иденти¬фикации возбудителя по его антигенной структуре или для индикации и идентификации бактериальных продуктов — токси¬нов в исследуемом патологическом материале. Соответственно используют стандартные (коммерческие) эритроцитарные анти¬тельные диагностикумы, полученные путем адсорбции специфи¬ческих антител на поверхности танизированных (обработанных танином) эритроцитов. В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные разведения исследуемого материала. Затем в каждую лунку вносят одинаковый объем 3 % суспензии на¬груженных антителами эритроцитов. При необходимости реакцию ставят параллельно в нескольких рядах лунок с эритроцитами, нагруженными антителами разной групповой специфичности.

Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): при отри¬цательной реакции появляется осадок в виде компактного.диска или кольца на дне лунки, при положительной реакции — харак¬терный кружевной осадок эритроцитов, тонкая пленка с неров¬ными краями.

39.Реакция нейтрализации на культуре клеток. Механизм. Практическое использование Реакция нейтрализации вирусов. При перенесении многих вирусных заболеваний или вакцинации в сыворотке крови людей обнаруживаются антитела, нейтрализующие инфекционные свойства соответствующих вирусов. Их обнаруживают при смешивании испытуемой сыворотки с вирусом с последующим заражением чувствительного животного либо клеточной культуры. Через несколько суток I регистрируют результаты опытов по гибели подопытного животного или ЦПД в пробирке с клеточной культурой.

Реакция нейтрализации вирусов нашла широкое применение в вирусологической практике для определения вида (типа) исследуемого вируса и титра вируснейтрализующих антител. В этих случаях используют соответствующие диагностические антисыворотки.

40. Реакция торможения гемагглютинации. Механизм. Практическое использование Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) — метод идентификации вируса или выявления противовирусных антител в сыворотке крови больного, основанный на феномене отсутствия агглютинации эритроцитов препаратом, содержащим вирус, в присутствии иммунной к нему сыворотки крови.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) является вариантом реакции нейтрализации вируса. Она основана на способности противовирусной антисыворотки подавлять вирусную гемагглютинацию эритроцитов определенных видов животных (кур, гусей и др.). Это объясняется способностью специфических антисывороток нейтрализовать вирусные гемагглютинины (рис. 19.5).

РТГА широко применяется для идентификации и типирования вирусов, а также для выявления антигемагглютининов в сыворотке крови исследуемых людей.