98.Методы индикаци вирусов.

Индикация вируса-обнаружение вируса в материале больного.

НА КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК:

*Цветная проба. Если цвет индикатора(красный) питательной среды 199 не изменяется, это свидетельствует о наличии возбудителя в материале. Если клетки живие и выделяют продукты метаболизма, то происходит изменение цвета индикатора на желтый.

*Цитопатическое действие(ЦПД)-разрушение монослоя клеток. Виды ЦПД: симпласт(образование монослоя клеток), очаговое(агрегация клеток), диффузное(сморщивание и деструкция, разрежение монослоя).

*Реакция гемадсорбции. Берем культуру клеток, зараженных вирусом, и вносим эритроциты. После некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим р-ром хлорида натрия. На поверхности клеток, пораженных гемагглютинирующим вирусом, остаются прилипшие эритроциты.

НА КУРИНЫХ ЭМБРИОНАХ:

*гибель эмбриона

*отставание в развитии

*ЦПД на оболочках эмбриона(некроз, кровоизлияния)

*гемагглютинация с жидкостями эмбриона

НА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ:

*отставание в развитии

*развитие характерного симптомокомплекса заболевания

*гибель животного

99. Методы идентификации вирусов.

Экспресс – диагностика. Для быстрой идентификации вирусной инфекции разработаны многочисленные методы экспресс – диагностики, основанные на обнаружение вирусных Аг. Напр.для ранней диагностики ВИЧ-инфекц. Широко используют ИФА, выявляющий поверхностные Аг вируса.Серологические методы. при большинстве вирусных инфекций развиваются иммунные реакции, применяемые для диагностики. Клеточные реакции обычно оценивают в тестах цитотоксичности лимфоцитов в отношении инфекционных агентов или зараженных ими кл.-мишеней либо определяют способность лимфоцитов отвечать на различные Аг и митогены.РН. Основана на подавлении цитопатогенного эффекта после смешивания вируса со специфичными АТ. Неизвестный вирус смешивают с известн. коммерческими антисыворотками и после соответствующей инкубации вносят в монослой кл. Отсутствие гибели кл.указывает на несоответствие инфекционного агента и известных АТ.РТГА. Применяют для идентификации вирусов, способных агглютинировать различные эритроциты. Для этого смешивают культуральную среду, содержащую возбудитель, с известной коммерческой антисыворотки и вносят в культуру кл. после инкубации определяют способность культуры к гемагглютинации и при ее отсутствии делают заключение о несоответствии вируса антисыворотке.Торможение цитопатического эффекта интерференцией вирусов. В культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят коммерческую сыворотку(к вир. Краснухи при подозрении на нее), инкубируют и заражают вторую культуру; через 1-2дн. В нее вносят известный цитопатогенный вирус. При наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, чтопервая культура была заражена вирусом, соответствовавшим примененным АТ.Прямая иммунофлюоресценция. (наиболее быстрая, чувствительная и воспроизводимая). Напр. Идентификация ЦМФ по цитопатогенному эффекту требует не менее 2-3нед., а при использовании меченных моноклониальных АТ идентификац. возможна уже через24ч. Имея набор подобных реагентов, их можно вносить в культуры, зараженные вирусом, инкубировать, отмывать несвязавшийся реагент и исследовать с помощью люминесцентной микроскопии.Иммуноэлектронная микроскопия. Позволяет идентифицировать различные виды вирусов, выявленные электронной микроскопией, что невозможно сделать, основываясь на морфологических особенностях. Вместо антисывороток для идентифик. используют помеченные разными способами АТ, но сложность и дороговизна метода ограничивают его применение.

100.Основные принципы лабораторной диагностики вирусных инфекций. Используют 3 метода лабораторной диагностики: вирусоскопический, вирусологический (ведущий метод), серологический.

Вирусоскопический метод заключается в обнаружении вируса в исследуемом материале под микроскопом. Чаще всего используют электронный микроскоп. Световая микроскопия из-за ничтожно малых размеров вирусов практически не применяется. И лишь для обнаружения крупных вирусов, применяя методы «сверхокраски», можно использовать световой микроскоп. Кроме того, с помощью свето­вого микроскопа можно выявить внутриклеточные включения, которые образуются в пораженных клетках при некоторых инфекциях.

Вирусологический метод заключается в заражении исследуемым материалом чувствительной биологической модели (лабораторные животные, куриные эмбрионы или культуры клеток), индикации вируса и его последующей идентификации. В культуре клеток наличие вируса определяют по цитопатическому действию гемадсорбции, феномену бляшкообразования, реакции гемагглютинации, отсутствию изменения окраски индикатора. Идентификация вируса осуществляется с помощью серологических реакций (РПГА, РТГА, РН, РСК, ИФА). Вирусологический метод позволяет точно определить природу возбудителя, но он требует достаточного много времени (5—7 дней и более).

Особенностью серологического метода в вирусологии является исследование парных сывороток. Первую сыворотку берут у больного в острый период в начале болезни, а вторую сыворотку берут через 10 дн. Сыворотки исследуют одномоментно. О болезни свидетельствует сероконверсия, т.е. нарастание титра антител во второй сыворотке по отношению к первой. Диагностической является сероконверсия в 4 раза и выше.