Глава 2

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ И ПРАВИЛА РАБОТЫ В НЕЙ

Микробиологи имеют дело с популяциями (культурами) микроорганизмов, состоящими из миллионов особей. Культуру, содержащую микро­организмы одного вида, называют чистой. Если в культуре содержится более одного вида микроорганизмов, она носит название смешанной. В микробиологической практике используют главным образом чистые культуры микроорганизмов. Ввиду того что в воздухе и на поверх­ности предметов (на столах, инструментах, одежде), а также на ру­ках, волосах и т. д. всегда имеется большое количество разнообразных микроорганизмов, следует постоянно заботиться о сохранении чистоты изучаемых культур. Требование чистоты культур в значительной степе­ни определяет специфику устройства микробиологической лаборатории и правила работы микробиолога.

Кроме основного рабочего помещения лаборатория имеет стерили­зационную, где размещены автоклавы и сушильные шкафы, бокс, мо­ечную, холодильную комнату, помещение для хранения культур и т. д.

Бокс служит для пересевов микроорганизмов и представляет собой не­большую изолированную комнату, разделенную перегородкой на две части. Вход в рабочее помещение бокса осуществляется через тамбур с раздвижной дверью, что исключает резкое перемещение воздуха и, следовательно, занесение извне посторонней микрофлоры. Оборудова­ние бокса состоит из стола, стула, газовой горелки и бактерицидной лампы, укрепленной в специальном штативе или смонтированной на потолке бокса. Удобно иметь в боксе подсобный стол, на котором раз­мещают необходимые во время работы предметы.

Рабочее место, где непосредственно проводится работа с культурами микроорганизмов, требует особенно тщательной обработки. Рабочий стол следует дезинфицировать не только до начала работы, но и после ее окончания. Для протирания поверхности стола можно ис­пользовать растворы лизола и хлорамина, а также 70%-ные (по объе­му) растворы изопропилового или этилового спиртов. Спирты весьма эффективны в отношении вегетативных форм микроорганизмов. Наз­ванные спирты можно также применять для дезинфекции рук. В тех случаях, когда поверхность стола имеет водоотталкивающее покрытие, особенно удобен лизол. Поверхность рабочего стола можно дезинфици­ровать и ультрафиолетовыми лучами. При этом следует учитывать, что бактерицидное действие лучей тем выше, чем ближе облучаемая по­верхность к источнику излучения.

В лаборатории не разрешается курить, есть, пить. Работать следу­ет в халатах.

В лаборатории микроорганизмы выращивают на плотных и в жид­ких питательных средах, которые разливают в пробирки, колбы, матра­цы и чашки Петри (рис. 25). Посуду и питательные среды предвари­тельно стерилизуют. Способы приготовления питательных сред и сте­рилизации подробно описаны в следующей главе пособия.

Внесение клеток микроорганизмов в стерильную среду называется посевом, или инокуляцией. Посев микроорганизмов требует соблюдения определенных правил, которые необходимо выполнять, чтобы предохра­нить исследуемую культуру от загрязнения посторонними микроорга­низмами. Перед посевом следует тщательно надписать на пробирке (колбе или чашке Петри) название микроорганизма и дату посева. Надпись делают чернилами по стеклу или на специально наклеенной этикетке.

Клетки микроорганизмов для посева или приготов­ления препаратов берут бактериологической петлей или иглой (рис. 26), если микроорганизмы выращены на плотной среде. В том случае, когда нужно пригото­вить препарат или пересеять культуры микроорганиз­мов, выросшие в жидкой питательной среде, лучше пользоваться не петлей, а стерильной пипеткой. Бактериологические петли и иглы делают, используя тон­кую проволоку из платины или нихрома, которую закрепляют в металлическом держателе или впаивают в стеклянную палочку. Диаметр бактериологической петли – 4 – 5 мм.

Рисунок 25. Посуда для культивирования микроорганизмов: 1 – качалочная колба; 2 – качалочная колба с отбойниками; 3 – коническая колба; 4 – чашка Петри; 5 – пробирка; 6 – матрац

Рисунок 26. Бактериологическая петля (1) и бактериологическая игла (2)

Бактериологическую петлю (иглу) перед взятием клеток микроор­ганизмов стерилизуют. Для этого проволоку накаливают докрасна в пламени горелки и одновременно обжигают примыкающую к петле часть держателя, которая будет вводиться внутрь сосуда, содержащего микроорганизмы. Петлю рекомендуется держать в пламени горелки почти вертикально, чтобы проволока была равномерно раскалена на всем протяжении. При прокаливании необходимо помнить, что наивысшая температура развивается в верхней и периферической частях пла­мени (рис. 27), поэтому не следует опускать петлю непосредственно к горелке. Сразу же после стерилизации петлю (иглу) вводят в сосуд с микроорганизмами. Чтобы не повредить клетки микроорганизмов, пет­лю (иглу) вначале охлаждают, прикасаясь ею к внутренней поверхно­сти сосуда или к питательной среде, свободной от клеток микроорга­низмов, и только после этого захватывают небольшое количество мик­робной массы.

Рисунок 27. Значение темпера­туры (в градусах Цельсия) в разных участках пламени газовой горелки

Отбор клеток микроорганизмов, выращенных на плотной среде в пробирке, осуществляют следующим образом (рис. 28). Пробирку с культурой берут в левую руку так, чтобы поверхность питательной среды с налетом выросших микроорганизмов была обращена кверху и хо­рошо видна. Пробирку держат в горизонтальном или несколько нак­лонном положении. В правую руку берут петлю так, как держат каран­даш, и прокаливают ее в пламени горелки. Затем, не выпуская петли, мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижимают ватную пробку к ладони, вынимают ее из пробирки и держат так во время по­следующих манипуляций. Края открытой пробирки с культурой микро­организмов обжигают в пламени горелки и после этого вводят в про­бирку стерильную петлю. Взяв небольшое количество микробной массы с поверхности субстрата, вынимают петлю из пробирки, следя за тем, чтобы переносимый материал не касался стенок или краев пробирки.

Горлышко пробирки снова обжигают в пламени горелки, затем обжи­гают ватную пробку и закрывают ею пробирку. Если конец ватной пробки загорится, то не следует бросать пробку. Ее нужно быстро вве­сти в пробирку, где вата сама потухнет. Ни в коем случае нельзя дуть на загоревшуюся пробку, так как это только усилит горение. Если в мо­мент пересева ватная пробка упадет на стол или на пол, то не следует снова вставлять ее в пробирку. Нужно взять новую стерильную пробку и начать всю операцию заново. Закрытую ватной пробкой пробирку с культурой ставят в штатив, а извлеченный материал используют для приготовления препарата или для пересева культуры в свежую среду.

Рисунок 28. Способ стерильного извлечения микроорганизмов с поверхности плотной среды

Если культуру пересевают на скошенную агаризованную среду, то петлю вводят в пробирку до конца и, слегка касаясь ею поверхности агара, проводят снизу вверх либо зигзагообразную, либо прямую черту - ­штрих. При этом стараются не повредить поверхность плотной среды. В случае пересева в жидкую среду (в колбы или пробирки) петлю с микробной массой погружают непосредственно в среду. Оставшиеся на петле после пересева или приготовления препарата клетки микроорга­низмов тщательно сжигают в пламени горелки. Прокаливание петли в этом случае начинают с участка проволоки, примыкающего к кольцу, для того, чтобы микробная масса, оставшаяся на петле, подсохла. За­тем петлю переводят в вертикальное положение и прокаливают докрасна. Такой порядок стерилизации петли необходим потому, что при быстром нагревании влажной микробной массы происходит ее разбрызги­вание и образуется аэрозоль, загрязняющий воздух. Только после про­каливания петлю можно положить на место.

Из жидкой среды клетки берут следующим образом: пипетку за верхний конец вынимают из бумаги или пенала, в которых она стерилизовалась, и вводят в пробирку или колбу с культурой, соблюдая все предосторожности, описанные выше (рис. 29). Отбирать жидкую куль­туру пипеткой можно с помощью резиновой груши. Использованную пипетку следует немедленно перенести в дезинфицирующий раствор, например 3-5% -ный водный раствор фенола или 2% -ный раствор хло­рамина, не касаясь ею ок­ружающих предметов.

Рисунок 29. Способ стерильного извлечения микроорганизмов из жидкой среды

Когда необходимо про­вести рассев микроорганиз­мов из жидкой питатель­ной среды на поверхность плотной среды в чашке Пет­ри, поступают следующим образом. Расплавленную на кипящей водяной бане стерильную питательную среду, содержащую агар или желатину, разливают в стерильные чашки Петри (рис. 30).

Рисунок 30. Разлив стерильной среды в чашки Петри

Для этого сосуд со средой берут в правую руку, вынимают из него пробку, зажимая ее мизин­цем и безымянным пальцем левой руки. Затем обжигают гор­ло сосуда в пламени горел­ки и, приоткрыв большими средним пальцами левой руки крышку чашки Петри, быстро наливают в чашку расплавленную среду в та­ком количестве (10-15 мл), чтобы дно чашки было полностью покрыто. Крыш­ку тотчас закрывают и чашку оставляют на гори­зонтальной поверхности до тех пор, пока не застынет среда. Для посева приоткрывают крышку чашки Петри и на поверхность плотной среды наносят каплю или «петлю» жидкой культуры, которую осторожно распределяют стеклянным стерильным шпателем (шпатель Дригальского) либо петлей.

Все описанные манипуляции следует проводить около пламени горелки (но не в пламени), по возможности быстро, чтобы не загряз­нить культуру посторонними микроорганизмами. Не рекомендуется делать резкие движения и ходить около лица, работающего с чистой культурой, так как движение воздуха увеличивает вероятность случайного ее загрязнения. После пересева пробирку или другие сосуды, в которых выращивают микроорганизмы, помещают в термостаты, где с помощью терморегуляторов поддерживается постоянная температура. Неаккуратное обращение с культурами микроорганизмов приводит к возникновению бактериального аэрозоля.