2.3.2. Оформление работы.

Рассмотреть под микроскопом и зарисовать в тетради форму и сочетание микробных клеток. Написать отчет о проделанной работе.

4. Контрольные вопросы.

1. Какую форму и размеры клеток могут иметь бактерии?

2. Какое строение имеет бактериальная клетка?

3. Как размножаются бактерии?

Рекомендуемая литература

[1] c.33-43, [2] c.18-41

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ И НЕГАТИВНЫЕ СПОСОБЫ ОКРАСКИ БАКТЕРИЙ.

3.1. Цель работы: приобретение навыков применения дифференцированных и негативных методов окраски препаратов микроорганизмов.

2. Общие сведения

Сложные или дифференцированные способы окраски микроорганизмов основаны на особенностях физико-химичекого строения клетки. Они применяются для детального изучения клеточных структур и для характеристики и дифференциации данного микроорганизма. При дифференциальной окраске применяют несколько красителей. Наибольшее практическое значение в микробиологической практике имеют окраска по Грамму и по Циль-Нильсену.

Красители делят на позитивные и негативные. Позитивные красители окрашивают клетки (при комнатной температуре в течение 30-60 секунд), негативные – пространство, окружающее микроорганизмы. В результате клетки выглядят силуэтами на фоне красителя.

Некоторые микроорганизмы (спирохеты) и отдельные структуры (внеклеточная слизь, капсулы), плохо выявляемые при помощи позитивных красителей, становятся хорошо заметными при окрашивании препаратов негативными красителями. Споры без соответствующей обработки не окрашиваются, поэтому при окрашивании бацилл позитивными красителями они окрашиваются как бы негативным способом и имеют вид преломляющих свет включений в вегетативных клетках.

3.3.Практическая часть.

3.3.1.Окраска микроорганизмов по Грамму.

Этот метод дифференциации микробных клеток основан на различии в химическом составе клеточных оболочек. Сущность его в том, что в клетках одних видов микроорганизмов образуется нерастворимое в спирте соединение йода с основным красителем. У других видов это соединение неустойчиво и после обработки спиртом растворяется. Микроорганизмы первой группы относят к грамположительным, а второй – к грамотрицательным. Окраска по Грамму является важным диагностическим признаком, она коррелирует со многими другими свойствами бактерий.

Как правило, по Грамму окрашиваются клетки молодых, чаще всего суточных культур, так как способность удерживать красители зависит от физиологического состояния бактерий.

Приборы, реактивы, посуда: микроскоп, предметные стекла, бактериологическая петля, фильтровальная бумага, капельница с водой, капельницы с растворами красителей, иммерсионное масло, стерильные пипетки, спиртовки.

3.3.1. 1.Методика выполнения работы

На хорошо обезжиренное предметное стекло нанести тонкий мазок исследуемого метериала (Bacillus mesentericus, Lactococcus lactis). Мазок высушить на воздухе, зафиксировать над пламенем спиртовки и окрасить в течение 1 минуты феноловым раствором генциана фиолетового (или кристаллического фиолетового), держа стекло в несколько наклонном положении. Слить краситель и, не промывая препарат водой, нанести на него раствор Люголя на 1 минуту (до полного почернения мазка). Стекло и в этом случае держать в наклонном положении. Слить раствор Люголя и, не промывая водой, обработать, непрерывно покачивая, 96% спиртом в течение 15 – 20 секунд. Время воздействия спирта очень существенно, так как при превышении указанного срока обесцвечиваются и грамположительные клетки, при недостаточном сроке обработки препарат оказывается перекрашенным. Промыть водой препарат и окрасить фуксином Пфейфера в течение 1 минуты. Слить избыток краски и промыть водой. Высушить препарат фильтровальной бумагой и исследовать с иммерсионной системой. После этой обработки грамположительные микроорганизмы окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные приобретают розовую окраску.