1.2 Продуценты бактериальной целлюлозы

Основными продуцентами БЦ являются бактерии рода Acetobacter, Pseudomonas, некоторые штаммы родов Rhizobium и Sarcina [7]. Плёнка БЦ, всплывая на поверхность среды, обеспечивает свободный проход кислорода к клеткам бактерий. У клубеньковых и опухолеродных бактерий БЦ может способствовать прикреплению клеток к телу хозяина - растения. Возможно еще, что целлюлозная одежда спасает клетки от ультрафиолетового излучения и, защищает их от нападения других микроорганизмов, а также от ядовитого воздействия металлов, например меди. В мокром виде БЦ предохраняет бактерии от высыхания. В сухом виде она помогает им разлететься на далекие расстояния [3].

Наиболее известным производителем БЦ является уксуснокислая бактерия Gluconacetobacter xylinus (Acetobacter xylinum, A. aceti ssp. xylinum, A. xylinus). «Ксилинус» по-гречески значит «древесная», «хлопковая». «Глюконацето» говорит о том, что глюкоза окисляется не до конца, а только до глюконовой кислоты. Если в среде есть винный или этиловый спирт, то он будет окисляться до уксусной кислоты (рисунок 1.4).

Рисунок 1.4 - Бактерии Acetobacter xylinum под световым микроскопом [3]

Клетки рода Acetobacter имеют эллипсоидную или палочковидную форму, прямые или слегка изогнутые, 0,6-0,8×1,0-4,0 мкм, одиночные, в парах или цепочках. У некоторых штаммов часто присутствуют инволюционные формы, которые могут быть сферическими, удлиненными, раздутыми, булавовидными, изогнутыми или нитевидными. Клетки подвижные или неподвижные; у подвижных жгутики перитрихиальные или латеральные. Эндоспор не образуют. По Граму окрашиваются отрицательно (в редких случаях вариабельно). Облигатные аэробы; метаболизм дыхательного типа, никогда не бродильного. Колонии бледные, большинство штаммов пигменты не продуцирует. Наилучшими источниками углерода для роста служат этанол, глицерол и лактат. Лактозу и крахмал не гидролизуют. Хемоорганотрофы. Оптимальная температура 25 - 30°С. Оптимальный диапозон рН 5,4 - 6,3. Виды Acetobacter встречаются на цветах, фруктах, пальмовом и виноградном винах, сидре, пиве, кефире, пивных дрожжах, уксусе и других продуктах [8].

Также учеными было обнаружено, что цианобактерия, одна из древнейших форм жизни, имеет генетическую способность синтезировать целлюлозу. Такие микроорганизмы были получены Малькольмом Брауном и Дэвидом Ноблсом путём ввода в цианобактерию набора генов, ответственных за производство целлюлозы, от нефотосинтезирующих бактерий Acetobacter xylinum (рисунки 1.5, 1.6).

Рисунок 1.5 - Слева: цианобактерии «дикого типа». Справа: модифицированные цианобактерии [3]

Цианобактерии используют солнечный свет как источник энергии и производят полисахариды и целлюлозу. Они способны поглощать атмосферный азот и потому не нуждаются в нитратных добавках. При этом все продукты жизнедеятельности бактерий могут быть собраны для дальнейшего использования без нанесения вреда микроорганизмам. В то же время, получение целлюлозы и полисахаридов существующими промышленными способами предполагает умерщвление микроорганизмов или использование механических процессов для ее выделения.

Цианобактерии можно выращивать на непахотных землях и использовать для «полива» соленую воду, которую нельзя использовать для питья или полива растений. Исходя из продуктивности цианобактерий в лаборатории, ученые подсчитали, площадь «полей» с цианобактериями будет в два раза меньше площади, засеянной растениями, используемыми как источник целлюлозы.

Рисунок 1.6 – Цианобактерии под микроскопом

БЦ является компонентом чайного гриба. По латыни чайный гриб именуется Medusomyces Gisevi и представляет собой симбиоз двух организмов: гриба, составленного из нескольких родов дрожжевых грибков (главным образом из рода Тоrulа), и уксуснокислых бактерий (Acetobacter xylinum, Acetobacter хylinoides и т. д.). Массивное тело гриба имеет форму диска, напоминающего по внешнему виду войлок. Верхняя часть колонии блестящая, плотная, сверху гриб гладкий, а нижняя играет роль ростковой зоны и имеет вид многочисленных свисающих нитей, внизу располагается более рыхлая колония дрожжевых грибов и уксуснокислых бактерий (рисунок 1.7).

Рисунок 1.7 - Чайный гриб [9]

Дрожжевые грибки в чайном грибе сбраживают сахар, образуя этиловый спирт, одновременно бактерии переводят спирт в уксусную кислоту, а сахарозу (сахар) - в глюконовую кислоту.

Чайный гриб подкармливают слабым настоем чая с 10%-ным содержанием сахара, а примерно раз в месяц устраивают ему промывку в кипяченой воде. Культивировать данный гриб можно будет лишь тогда, когда он изрядно разрастется и станет многослойным. Оптимальной для гриба считается температура 25°С, вредной - ниже 17 - 18°С. В этом случае активность гриба резко снижается и в нем начинают заводиться сине-зеленые водоросли, которые убивают гриб [9].

Также БЦ является одним из полисахаридов молочного гриба и индийского риса. Внешне молочный гриб представляет собой белое тело, напоминающее шар. В начальной стадии его диаметр составляет 5 - 6 мм, а в конечной стадии, перед делением, уже 40 - 60 мм [2]. Индийский рис внешне напоминает рисовые зёрнышки (рисунок 1.8). Они, в начальном периоде развития, достигают в диаметре 5 - 6 мм, постепенно увеличиваются и перед делением могут вырасти до 40 - 50 мм [10].

Рисунок 1.8 - Индийский рис [10]

Механизм синтеза БЦ изучается главным образом в клетках бактерий рода Gluconacetobacter. К настоящему времени обнаружены четыре гена (А, В, С и D), которые кодируют белки целлюлозосинтазного комплекса. Установлено, что гены находятся в одном опероне. Если инактивировать любой из первых трех генов, синтез целлюлозы прекратится, но выключение гена D приведет только к снижению продукции на 40 % и при этом изменяется и свойства целлюлозы.

Пусть биосинтеза БЦ начинается с глюкозы, которая фосфорилируется с помощью фермента глюкокиназы. Затем происходит изомеризация глюкозо – 6 – фосфата в глюкозо – 1 – фосфат ферментом фосфоглюкомутазой и синтез UDP – глюкозы под действием UDPG – пирофосфорилазы. Уридиндифосфатглюкоза является непосредственным предшественником полимера. Позвенное наращивание цепи целлюлозы производится комплексом белков (с общим названием целлюлозосинтазы), связаннм с мембраной. Каждый такой комплекс синтезирует 60 – 70 цепей целлюлозы, которые, будучи «прошиты» водородными связями, образуют одну микрофибриллу.

Микрофибриллы БЦ по одной через особые отверстия выдавливаются из клетки, где 10 – 100 микрофибрилл самопроизвольно объединяются в ленту. Множество лент переплетаются в сеть, в которой запутываются бактерии, и все это в виде слизистой пленки всплывает на поверхность. Толщина гель – пленки за месяц может дойти до 2,5 см [11].

Состав питательной среды отличается тем, что в качестве источника углерода и азота он содержит сахаросодержащие отходы сахарного производства. В качестве восполнителя дефицита азота состав содержит пептон, в качестве источника витаминов - дрожжевой экстракт, ускорителя биосинтеза целлюлозы - этанол. Сбалансированный состав питательной среды культивирования Acetobacter xylinum позволяет получать высокие выходы БЦ, обладающей уникальными свойствами по сравнению с растительной целлюлозой, и частично утилизировать промышленные отходы [12].