1. Генная инженерия как метод.

В 1972 г. появилась первая публикация, в которой сообщалось о получении in vitro (вне организма) рекомбинантной ДНК, состоящих из фрагментов разных молекул ДНК: вирусной, бактериальной и фаговой. Работа была выполнена американским ученым Полом Бергом, это ознаменовало рождение генной инженерии.

Согласно определению академика Баева А.А.: генная (генетическая) инженерия – это конструирование in vitro функционально активных генетических структур, т.е. создание искусственных генетических программ.

С этого момента прошло уже больше четверти века, свершение генной инженерии весьма внушительны, а перспективы – фантастичны.

Теоретические основы генной инженерии

Молекулярные механизмы матричного синтеза:

Репликация: ДНК→ ДНК

Транскрипция: ДНК→ РНК

Трансляция: РНК→ белок

Рекомбинация – обмен генами у гомологичных хромосом при половом процессе.

Плазмиды - кольцевые малые молекулы ДНК, автономно размножающиеся в бактериальной клетке.

Рестриктазы - ферменты, способные расщеплять ДНК в строго определенном месте с образованием «липких концов» у образуемых фрагментов.

Отличия генной инженерии от классической селекции

Селекция	Генная инженерия
1. Нельзя скрещивать неродственные виды 2. Нельзя извне управлять процессом рекомбинации в организме 3. Нельзя точно угадать, какое получиться потомство	1. Можно скрещивать индивидуальные гены видов, стоящих на разных ступенях эволюции, т.е. происходит скрещивание гетерологичных ДНК 2. Можно управлять процессом рекомбинации, т.к. он происходит in vitro, т.е. «в пробирке» и не защищен запрещающими механизмами организма. 3. Можно предсказать результат, т.к. отбирается потомство одной молекулы ДНК (молекулярное клонирование)

Таким образом, в генной инженерии преодолеваются все ограничения классической селекции. Можно скрещивать отдельные гены «ужа и ежа»

2. Механизм генной инженерии.

Рекомбинация в организме (in vitro) возможна только между гомологичными молекулами ДНК. Оказалось, что вне организма притягивание молекул ДНК возможно, если они будут иметь небольшие комплиментарные участки (из четырех и более нуклеотидов) на концах молекул – так называемые «липкие концы».

Поэтому, если в пробирку поместить самые разные ДНК с одинаковыми «липкими концами», то рекомбинация возможна.

Чтобы полученные генные конструкции заработали, необходимо их ввести в подходящую бактериальную клетку. Для этого необходимы «повозки»- векторные молекулы. К числу векторов относятся плазмиды, бактериофаги и вирусы животных. Векторы должны обладать рядом особенностей:

А) Репликация в клетке – хозяине.

Б) Содержание маркерного гена, по которому его легко было бы распознать (для бактериальных векторов чаще всего используются маркерные гены, вызывающие устойчивость к некоторым антибиотикам).

Чаще других в генной инженерии в качестве векторов используют плазмиды бактериального происхождения (их размер 1-3 %генома бактериальной клетки)

Плазмиду режут рестриктазами, чтобы получить «липкие концы», комплиментарные концам встраиваемых генов. Проводят гибридизацию гена и плазмиды и рекомбинантную плазмиду вводят в бактериальную клетку. В этих клетках химерная (гибридная) плазмида начинает функционировать (репликация, транскрипция, трансляция, синтез белка). Таким образом, in vitro происходит только рекомбинация, а все остальные превращения с химерной плазмидой происходят в клетке так же, как и с собственными ДНК. Иными словами, в бактериальную клетку можно ввести ген любого организма (слона, обезьяны, человека) и заставить его там функционировать.

Таким образом, процедура генной инженерии сводится к следующим этапам:

А. Рекомбинация in vitro ДНК-гена и ДНК-вектора (плазмиды).

Б. Введение рекомбинантной плазмиды в клетку.

В. Молекулярное клонирование: клетка синтезирует нужное вещество.

Кроме клонирования генов в бактериальных клетках (почвенная бактерия, E.coli), используется клонирование в дрожжах, стрептомицетах, сахаромицетах, а также в клетках животных.

Работа с дрожжами облегчается тем, что подобно бактериям они могут расти в жидкой среде, имеют короткое время регенерации. Процедура внедрения ДНК в клетки дрожжей проста: удаляется клеточная стенка, и мембрана становится проницаемой. Такие грибы с химерной плазмидой начинают активно синтезировать чужеродные белки. Способы переноса генов в клетки животных будут рассмотрены далее.