- •Список сокращений
- •Введение
- •Обзор литературы
- •Повсеместное распространение патогенов в окружающей среде
- •1.2 Salmonella typhimurium – патоген человека и животных
- •1.3 Особенности ультраструктуры некультивируемых форм микроорганизмов
- •Способы переживания неблагоприятных условий бактериями
- •1.5 Голодание как основной фактор перехода бактерий в некультивируемое состояние
- •1.6 Формирование адаптивного ответа бактерий на стресс
- •1.7 Межклеточная коммуникация у бактерий рода Salmonella
- •1.8 RpoS глобальный регулятор системы ответа на стресс
- •Экспериментальная часть
- •2. Материалы и методы
- •2.1 Культивирование микроорганизмов
- •2.2 Оценка роста бактериальной культуры
- •2.3 Конструирование праймеров
- •2.4 Выделение днк
- •2.5 Спектрофотометрическое определение концентрации днк
- •2.6 Электрофорез днк в агарозном геле
- •2.7 Количественная полимеразная цепная реакция (кПцр)
- •2.8 Окрашивание клеток Salmonella Typhimurium 14028s wt витальными красителями и их анализ при помощи конфокальной флуоресцентной микроскопии
- •2.9 Приготовление проб для электронной микроскопии
- •2.10 Статистическая обработка данных
- •Результаты и обсуждение
- •3.1 Определение титра кое голодающей культуры s. Typhimurium.
- •3.2 Определение титра геномных копий (гк) голодающей культуры s. Typhimurium 14028s wt на основе количественного пцр
- •3.3 Оценка жизнеспособности клеток s. Typhimurium 14028s с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии
- •3.4 Морфологические особенности клеток голодающей популяции s. Typhimurium 14028s wt с низкой и высокой начальной плотностью
- •3.5 Оценка фенотипа клеток s. Typhimurium 14028s ΔluxS::KanR в условиях голодания
- •3.6 Оценка фенотипа клеток s. Typhimurium 14028s ΔrpoS::KanR в условиях голодания
- •Список использованной литературы
Экспериментальная часть
2. Материалы и методы
2.1 Культивирование микроорганизмов
Объектами исследования служили клетки штаммов Salmonella typhimurium 14028S WT, ΔluxS::KanR, ΔrpoS::KanR. Клетки бактерий выращивали на среде LB (Luria-Bertani) (Sambrook et. al, 1989), содержащей на 1 л: 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, рН 7,5, в термостатируемом шейкере-инкубаторе IS-971R (JEIO TECH, Южная Корея) при 160 оборотах/мин и 28 оС. При необходимости в среды добавляли канамицин в концентрации 34 мкг/мл. В качестве инокулята использовали культуры стационарной фазы роста c оптической плотностью клеточной суспензии – 0.3 (λ = 600 нм).
Для создания условий голодания клетки микроорганизмов осаждали центрифугированием и ресуспендировали в эквивалентном объеме безуглеродной минеральной среды АВ, содержащей (г/л): NH4Cl, 1; MgSO4 7H2O, 0.62; KCl, 0,15; CaCl2х2H2O, 0,013; FeSO4х7H2O, 0,005, pH 7,5. Процедуру повторяли дважды, после чего готовили клеточные суспензии в серии десятикратных разведений и инкубировали их при 28 °С без аэрации.
2.2 Оценка роста бактериальной культуры
Оценку роста культур клеток проводили по количеству колониеобразующих единиц в миллилитре культуры (КОЕ/мл) стандартным методом (Блажевич, 2004). Суспензию клеток микроорганизмов последовательно разводили в среде АВ в серии десятикратных разведений. По 0,1 мл из каждого разведения наносили на чашки Петри, содержащие 20 мл агаризованной среды LB (1,5 % бактоагара Ferak Berlin, Германия) и растирали по поверхности при помощи шпателя Дригальского. Засеянные чашки Петри инкубировали в термостате при 28 оС. Подсчет колоний проводили через сутки после посева, на чашках, в которых вырастало от 20 до 200 колоний. Титр КОЕ в исходной культуре определяли по среднему числу колоний, с учетом степени разведения. Определение динамики роста культур клеток проводили спектрофотометрическим методом на спектрофотометре λ-25 фирмы Perkin Elmer (США) при длине волны λ = 600 нм.
2.3 Конструирование праймеров
Для конструирования праймеров использовали пакет программ Vector NTI 9. Для поиска гомологичных нуклеотидных последовательностей во всемирном банке генов использовали web-ресурсы сайта NCBI, программы Blast, опция – nucleotid-nucleotid BLAST Search. Все олигонуклеотиды были синтезированы НПО «Синтол» (Москва).
2.4 Выделение днк
Для получения очищенных препаратов ДНК S. typhimurium 14028S WT использовали модифицированный фенольный метод (Маниатис с соавт., 1984). Клетки микроорганизмов собирали центрифугированием при 8000 g, 4 оС, 10 мин и суспендировали в буфере TES (50 мМ трис-HCl, pH 8.0; 20 мМ ЭДТА; 100 мМ NaCl). К суспензии добавляли лизоцим из расчета 100 мкг/мл и инкубировали при температуре 37 оС 20 минут. Затем клетки лизировали добавлением додецилсульфата натрия (SDS) до 1%. Полученные лизаты выдерживали 15 минут при 65 оС. Для выделения ДНК использовали метод фенольной экстракции (Маниатис с соавт., 1984). Лизат охлаждали до комнатной температуры и экстрагировали равным объемом смеси фенола, насыщенного трисом, (рН 8.0) с хлороформом (1:1). Водную фазу отделяли центрифугированием (8000 g, 20 оС, 10 мин.) и повторяли экстракцию смесью хлороформ-изоамиловый спирт (24:1). ДНК из водной фазы осаждали добавлением ацетата натрия до 0.3 М (рН 5.2) и 3 объемов холодного (−15 оС) 96% этанола. Осадок промывали 70 % этанолом и растворяли в TE буфере (10мМ трис-НСl, рН 8.0; 1 мМ ЭДТА-Na). Для дополнительной очистки раствор инкубировали в присутствии 20 мкг/мл РНКазы А (Serva, ФРГ) 1 ч при 37 оС, затем 50 мкг/мл протеиназы К (Sigma, США) 1 ч при 37 оС. После ферментативной обработки ДНК снова экстрагировали смесью фенол-хлороформ, затем смесью хлороформ-изоамиловый спирт и осаждали 3 объемами 96 % этанола.