3.3 Оценка жизнеспособности клеток s. Typhimurium 14028s с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии

В диагностики инфекционных заболеваний значительную роль играет метод ПЦР, который позволяет определить видовую принадлежность бактерий в инфицированном организме. Однако, данный подход может приводить и к показанию ложноотрицательных результатов. Это связано с тем, что бактериальные клетки способны трансформироваться в особые морфотипы, отличные от типичных вегетативных клеток. При этом изменение морфологии бактериальных клеток и их физиологического состояния часто бывает сопряжено с модификацией структуры генетического аппарата, приводящей к неэффективности выявления покоящихся форм микроорганизмов при помощи ДНК-диагностики. Такие «нетипичные» морфотипы (например, жизнеспособные, но некультивируемые формы и цистоподобные рефрактерные клетки) позволяют бактериям переживать стрессовые условия. Кроме того, есть основания считать, что эти морфотипы необходимы также для успешного протекания инфекционного процесса и являются важной стадией жизненного цикла популяции микробов.

На сегодняшний день известно, что популяция бактериальных клеток неоднородна и может быть представлена различными типами клеток, выполняющими разные функции (Олескин с соавт., 2000). В ней могут присутствовать как вегетативные клетки, необходимые для активного размножения и расселения, так и покоящиеся клетки различного типа, устойчивые к тем или иным неблагоприятным факторам. Вероятно, соотношение клеток различного типа в популяции определяет ее свойства. В связи с этим разработка способов выявления жизнеспособных клеток в популяциях «нетипичных» физиологических форм бактерий является актуальной задачей.

Для решения поставленной задачи были заложены опытные культуры S. typhimurium 14028s WT с начальной плотностью клеток 10⁹ КОЕ/мл по схеме, описанной в разделе «материалы и методы». Численность культивируемых (вегетативных) клеток оценивали при помощи определения титра колониеобразующих единиц (КОЕ). При помощи коммерческого набора BacLightTM Bacterial Viability определяли титр клеток сохранивших интактность мембран (жизнеспособные клетки) и общий титр клеток. Для этого клетки окрашивали красителями пропидиум иодидом и SYTO 9 как описано в разделе материалы и методы, добавляли к ним раствор легкоплавкой агарозы (Bio-Rad, США) до 0,5% и 5 мкл полученной суспензии переносили на предметное стекло. Затем с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии проводили пошаговое (2 мкм) сканирование по оси Z заданного объема застывшей агарозы (28, 57  28,57  26,00-32,00 мкм) по результатам которого получали трехмерное изображение клеточных суспензий (Рис. 8). Далее в полученном просканированном объеме подсчитывали как количество клеток, сохранивших интактность мембран, (живые клетки), так и общее число клеток и пересчитывали на количество клеток в 1 мл для сопоставления с титром геномных копий, определяемом при помощи ПЦР РВ и с титром КОЕ.

Рисунок 8. Трехмерное изображение суспензий клеток S. typhimurium 14028s WT, инкубированных в среде AB в течение: А) 0 суток, Б) 16 суток. Масштабная метка соответствует 1 мкм.

При помощи данного метода нами было показано, что динамика титра жизнеспособных клеток (сохранивших интактность мембран) практически совпадала с общим титром клеток 3,6×109–3,5×109 КОЕ/мл.