МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ

КАФЕДРА БИОХИМИИ

Специальность: 012300, 020208 – биохимия

Специализация: 012308, 012105 – молекулярная фармакология

ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА

ХАРАКТЕРИСТИКА АДАПТИВНОГО ОТВЕТА ПАТОГЕННОЙ БАКТЕРИИ SALMONELLA TYPHIMURIUM 14028S WT НА УСЛОВИЯ ГОЛОДАНИЯ

Работа завершена:

«___» _________20__г. ____________(И.И. Гильмутдинова)

Работа допущена к защите:

Научный руководитель

к.б.н., научный сотрудник

«___» _________20__г. ____________(Н.Е. Гоголева)

Заведующий кафедрой

д.б.н., профессор

«___» _________20__г. ____________(Ф.К. Алимова)

Казань – 2013 г.

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ……………………………………… 4

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………. 5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………. 8

1.1 Повсеместное распространение патогенов в окружающей среде …………………………………………………………………….. 8

Salmonella typhimurium – патоген человека и животных…. 10 Особенности ультраструктуры некультивируемых форм микроорганизмов……………………………………………….. 12 Способы переживания неблагоприятных условий……….. 13

1.5Голодание как основной фактор перехода бактерий в некультивируемое состояние…………………………………... 15 Формирование адаптивного ответа бактерий на стресс…. 18 Межклеточная коммуникация у бактерий рода Salmonella ……………………………………………………………………. 20 1.8 RpoS глобальный регулятор системы ответа на стресс… 23

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ………………………….. 26

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ……………………………….. 26

2.1. Культивирование микроорганизмов…………………….. 26 2.2 Оценка роста бактериальной культуры……………………. 26 2.3 Конструирование праймеров……………………………….. 27 2.4 Выделение ДНК……………………………………………... 27 2.5 Спектрофотометрическое определение концентрации ДНК ……………………………………………………………………. 28 2.6 Горизонтальный электрофорез ДНК в агарозном геле…... 28 2.7 Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ) …………………………………………………………………... 29 2.8 Окрашивание клеток Salmonella Typhimurium витальными красителями и их анализ при помощи конфокальной флуоресцентной микроскопии……………………………….. 30 2.9 Приготовление проб для электронной микроскопии….. 31 2.10 Статистическая обработка данных…………………….. 32 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ……………………….. 33 3.1 Определение титра КОЕ голодающей культуры S. typhimurium 14028S WT………………………………….. 33 3.2 Определение титра геномных копий (ГК) голодающей культуры S. typhimurium 14028S WT на основе ПЦР в реальном времени ………………………………………………………………… 36 3.3 Оценка жизнеспособности клеток S. typhimurium 14028s WT с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии …………………………………………………………........... 42 3.4 Морфологические особенности клеток голодающей популяции S. typhimurium 14028S WT с низкой и высокой начальной плотностью ………………………………………………………………… 44 3.5 Оценка фенотипа клеток S. typhimurium 14028S ΔluxS::KanR в условиях голодания………………………………………. 47 3.6 Оценка фенотипа клеток S. typhimurium 14028S ΔrpoS::KanR в условиях голодания……………………………………… 49

ВЫВОДЫ…………………………………………………… 51

ЛИТЕРАТУРА……………………………………………… 52

Список сокращений

АГЛ – ацилгомосерин лактоны

АОБ – алкилоксибензолы

ГК – голодающие культуры

ДПС – ДНК – связывающий Протеин Стационарной фазы клеток

КОЕ – колониеобразующие единицы

Н - нуклеоид

НМ – наружная мембрана

ПП – периплазматическое пространство

ПЦР-РВ – полимеразная цепная реакция в реальном времени

ЦПМ – цитоплазматическая мембрана

Ц - цитоплазма

НС – некультивируемое состояние

LB – среда Luria – Bertani

Rpf – Resuscitation promoting factor

SDS – додецилсульфат натрия

Введение

Патогенные микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae широко распространены. В естественных экосистемах эти патогены обнаруживаются повсеместно (Литвин, 1983). Общепризнано, что заболеваемость населения кишечными инфекциями напрямую связана с качеством потребляемой воды. В воде многих источников могут присутствовать сальмонеллы, шигеллы, кишечная палочка и другие патогенные микроорганизмы. Попадая в природные водоемы патогенные микроорганизмы часто находятся в состоянии лимита того или иного субстрата, необходимого для их жизнедеятельности, то есть в состоянии голодания, а также под воздействием различных абиотических и биотических факторов. Однако такие лимитирующие условия не только не вызывают гибель бактерий, но запускают защитные механизмы, обеспечивающие сохранение жизнеспособности и вирулентности патогенов. Длительность выживания в воде патогенных микроорганизмов зависит от множества факторов, в том числе от способности микроорганизмов развивать различные адаптивные ответы (переход в некультивируемое состояние, образование покоящихся форм). По видимому, в почвенных и водных экосистемах, наряду с факторами, лимитирующими популяции патогенных бактерий, действуют факторы, поддерживающие их устойчивое существование и обеспечивающие жизнеспособность возбудителей инфекций вне обязательной связи с теплокровными животными или растениями. Выяснение стратегии выживания в природных условиях патогенных микроорганизмов представляется актуальным с точки зрения контроля над распространением инфекций.

Одним из социально значимых представителей семейства Enterobacteriaceae является Salmonella typhimurium штамм 14028S WT – патоген человека и животных. Ежегодно токсикоинфекции, вызванные сальмонеллой, поражают около 20 миллионов человек во всем мире, среди которых гибнет около 200 тысяч. При этом зачастую вспышки сальмонеллеза связывают с употреблением в пищу продуктов растениеводства (Asplund, 1991). Широкое распространение сальмонелл объясняется ее способностью адаптироваться к изменениям окружающей среды. Специфические сигналы и стрессовые условия приводят к активации сигма-фактора – глобального регулятора системы ответа на различные стрессы – альтернативной -субъединицы РНК-полимеразы RpoS (^S или ³⁸) (Yildiz et. al, 1998). Активация физиологической программы ответа на стресс, в частности, вызванного голоданием, осуществляется у бактерий при участии сигнальных систем межклеточной коммуникации, то есть регулируется на популяционном уровне (McDougald et. al, 2007). Для изучения сигнальных систем бактерий информативным подходом является анализ фенотипов, мутантных по генам различных компонентов сенсорно-регуляторных систем. Этот подход дает возможность оценивать влияние сигнальных систем на свойства микроорганизмов. В связи с этим в данной работе были использованы штаммы S. typhimurium 14028S в которых удалены гены luxS, кодирующий синтазу аутоиндуктора 2 типа, и rpoS, кодирующий альтернативную -субъединицу РНК-полимеразы,

Целью работы являлась характеристика процессов, обеспечивающих формирование адаптивного ответа S. typhimurium 14028S WT на условия голодания. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Определить динамику титра колониеобразующих единиц и титра геномных копий в голодающих культурах S. typhimurium 14028S WT при различной исходной концентрации бактерий.

2. Охарактеризовать ультраструктурные особенности клеток в голодающих культурах S. typhimurium 14028S WT.

3. Определить динамику титра колониеобразующих единиц в голодающих культурах при различной исходной концентрации бактерий штаммов S. typhimurium 14028S мутантных по гену luxS, кодирующему синтазу аутоиндуктора 2 типа.

4. Определить динамику титра колониеобразующих единиц в голодающих культурах при различной исходной концентрации бактерий штаммов S. typhimurium 14028S мутантных по гену rpoS, кодирующему альтернативную -субъединицу РНК-полимеразы.