Приготовление сред

Посуда для приготовления сред не должна содержать посторонних веществ, например щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла, или окислов железа, которые могут попасть в среду при варке ее в ржавых кастрюлях. Лучше всего пользоваться стеклянной, эмалированной или алюминиевой посудой. Большие количества среды (десят­ки и сотни литров) готовят в специальных варочных котлах или реакторах (рис. 14). Перед употреблением посуду необходимо тщательно вымыть, прополоскать и высушить. Новую стеклянную посуду предварительно кипятят 30 мин в 1—2% растворе хлороводородной кисло­ты или погружают в этот раствор на ночь, после чего в течение часа прополаскивают в проточной воде.

Внимание! Посудой, предназначенной для приготовления сред, нельзя пользоваться в других целях, например для хранения химических реактивов или дезинфицирующих растворов—даже следы этих веществ могут помешать росту микроорганизмов.

Исходным сырьем для приготовления большинства сред служат продукты животного или растительного происхож­дения: мясо и его заменители, молоко, яйца, картофель, соя, кукуруза, дрожжи и др.

Основные питательные бульоны готовят на мясной воде или на различных переварах, полученных при кислот­ном или ферментативном гидролизе исходного сырья. Бульоны из переваров в 5—10 раз экономичнее, чем из мясной воды. Среды на переварах богаче аминокислотами, следовательно, питательнее; обладают большей буферностью, т. е. имеют более стабильную величину pH. Кроме того, перевары можно готовить из заменителей мяса (сгустков крови, плаценты, казеина и т. д.).

В настоящее время снабжение лабораторий мясной водой и переварами централизованно. Чаще пользуются панкреатическим переваром Хоттингера, гидролизатами казеина или кормовых дрожжей. Из этих полуфабрикатов по определенным рецептам готовят необходимые среды.

Этапы приготовления сред: 1) варка; 2) установление оптимальной величины pH; 3) осветление; 4) фильтрация;

разлив; 6) стерилизация; 7) контроль.

Варят среды на открытом огне, водяной бане, в автоклаве или варочных котлах, подогреваемых паром.

Установление pH сред ориентировочно производят с помощью индикаторных бумажек. Для точного определе­ния pH пользуются потенциометром, применяя стек­лянные электроды в соответствии с инструкцией или компаратором (аппарат Михаэлиса), состоящим из штатива с гнездами для пробирок и набора стандартов определенного pH. При приготовлении сред пользуются обычно индикатором метанитрофенолом, из­меняющим свой цвет в диапазоне 6,8—8,4.

Для определения pH среды 4 пробирки, диаметр и цвет стекла которых не отличается от пробирок со стандарта­ми, помещают и гнезда I, 2, 3 и 5 (см. рис. 15). В 1-ю и 3-ю пробирки наливают по 5 мл дистиллированной воды; в 5-ю — 7 мл; во 2-ю — 4 мл воды и 1 мл индикатора. В гнезда 4 и 6 ставят стандарты нужного pH. В 1-ю, 2-ю и 3-ю пробирки наливают 2 мл охлажденной среды. Содер­жимое пробирок смешивают.

Цвет жидкостей в пробирках сравнивают в проходя­щем свете, закрыв заднюю прорезь прибора фильтром (матовым или синим, если жидкости интенсивно желтые). pH испытуемого раствора соответствует pH стандарта, с цветом которого совпадает его цвет.

Готовя среды с заданным pH, в гнезде 4 и 6 ставят стандарты, pH которых близок к требуемому, а во 2-ю пробирку с испытуемой средой и индикатором добавляют из бюретки определенное количество раствора щелочи, если жидкость во 2-й пробирке светлее стандартов, или раствора кислоты — если светлее стандарты. Щелочь (или кислоту) приливают до тех пор, пока цвет жидкости во 2-й пробирке не совпадает с цветом стандартов. Количество щелочи (или кислоты), прибавленное к 2 мл среды во 2-й пробирке, пересчитывают на весь объем приготовленной среды. Например, если для получения нужного pH на 2 мл среды пошло 2 капли (0,1 мл) 0,05 н. раствора щелочи, то для подщелачивания 1 л нужно в 500 раз больше, т. е. 50 мл 0,05 н. или 2,5 мл 1 н. раствора щелочи.

При стерилизации pH сред снижается на 0,2, поэтому для получения среды с pH 7,2—7,4 ее сначала готовят с pH 7,4—7,6.

Осветление сред производят, если при варке они мутнеют или темнеют. Для осветления в среду, подогре­тую до 50 °С, вливают белок куриного яйца, взбитый с двойным количеством воды, перемешивают и кипятят. Свертываясь, белок увлекает в осадок взвешенные в среде частицы. Таким же способом можно вместо яичного белка использовать сыворотку крови (20—30 мл на 1 л среды).

Фильтрацию жидких и расплавленных желатиновых сред производят через влажный бумажный или через матерчатые фильтры. Фильтрация агаровых сред затруд­нена— они быстро застывают. Обычно их фильтруют через ватно-марлевый фильтр (в воронку помещают мар­левую салфетку и на нее пышный комок ваты). Можно пользоваться бумажными или матерчатыми фильтрами, если проводить фильтацию в горячем автоклаве или в воронках с подогревом.

Фильтрацию агаровых сред можно заменить отстаива­нием. Среду наливают в высокий цилиндрический сосуд и расплавляют в автоклаве. При медленном остывании среды в выключенном приборе взвешенные в ней частицы оседают на дно. На следующий день агаровый сгусток извлекают из сосуда (для этого сосуд ненадолго помеща­ют в горячую воду) и отрезают ножом нижнюю часть со скопившимся осадком. Верхнюю часть растапливают и разливают в соответствующие емкости.

Разливают среды в пробирки (по 3—5 мл или по 10 мл), флаконы, колбы, матрацы и бутылки не более чем на 7э емкости, так как при стерилизации могут намокнуть пробки и среды утратят стерильность.

Среды, которые стерилизуют при температуре выше 100 °С, разливают в чистую сухую посуду. Среды, стери­лизуемые при более низкой температуре, обязательно разливают в стерильную посуду.

Разливают среды с помощью воронки, на конец кото­рой надета резиновая трубка с зажимом Мора. Для мерного разлива применяют мензурки, бюретки, дозато­ры, шприцы-пипетки и т. п. (рис. 16).

Посуду со средой обычно закрывают ватно-марлевыми пробками, поверх которых надевают бумажные колпачки. Важно, чтобы при разливе среда не смачивала края посуды, иначе к ним могут прилипнуть пробки. К каждо­му сосуду обязательно прикрепляют этикетку с названием среды и датой ее приготовления.

Стерилизация. Режим стерилизации зависит от состава среды и указан в ее рецепте.

Контроль готовых сред: а) для контроля стерильно­сти среды ставят в термостат на 2 сут, после чего просматривают. Если на средах не появятся признаки роста, их считают стерильными и передают для химиче­ского контроля по нескольку образцов каждой серии; б) химический контроль: окончательно устанавливают pH, содержание общего и аминного азота, пептона, хлоридов (их количество должно соответствовать указан­ному в рецепте).

Химический контроль сред производят в химической лаборатории; в) для биологического контроля нес­колько образцов среды засевают специально подобранны­ми культурами микроорганизмов, и по их росту судят о питательных (ростовых) свойствах среды. К готовой среде прилагают этикетку и паспорт, в котором указывают название и состав среды, результаты контроля и др.

Хранят среды при комнатной температуре в шкафах, желательно специально для них предназначенных. Неко­торые среды, например среды с кровью и витаминами, хранят в холодильнике.