Темнопольная микроскопия

Темнопольная микроскопия основана на способности микроорганизмов сильно рассеивать свет. Для темнополь­ной микроскопии пользуются обычными объективами и специальными темнопольными конденсорами. Существует несколько типов таких конденсоров, различающихся по устройству.

Основная особенность темнопольных конденсоров за­ключается в том, что центральная часть у них затемнена и прямые лучи от осветителя в объектив микроскопа не попадают. Объект освещается косыми боковыми лучами и в объектив микроскопа попадают только лучи, рассеянные частицами, находящимися в препарате. Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля, известным примером которого служит обнаружение пылинок в возду­хе при освещении их узким лучом солнечного света.

Чтобы в объектив не попадали прямые лучи от осветителя, апертура его должна быть меньше, чем апертура конденсора. Для уменьшения апертуры в обыч­ный объектив помещают диафрагму или пользуются специальными объективами, снабженными ирисовой диаф­рагмой.

При темнопольной микроскопии микрооорганизмы вы­глядят ярко светящимися на черном фоне. При этом способе микроскопии могут быть обнаружены мельчайшие микроорганизмы, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности микроскопа. Однако темно­польная микроскопия позволяет увидеть только контуры объекта, но не дает возможности изучить внутреннюю структуру.

Обычно с помощью темнопольной микроскопии изуча­ют препараты типа «раздавленная капля». При этом очень строгие требования предъявляются к качеству предмет­ных и покровных стекол и приготовлению препарата. Предметные стекла должны быть не толще 1,1 —1,2 мм, покровные — 0,17 мм, без царапин и загрязнений. При приготовлении препарата следует обращать особое внима­ние на отсутствие пузырьков и крупных частиц (все эти

Микроскопируют с помощью иммерсионной системы. Фон препарата черный, клетки — красные, капсулы — неокрашенные (см. рис. 4).

дефекты будут видны ярко святящимися и не позволят наблюдать препарат).

Для темнопольной микроскопии необходимы яркие источники света, поэтому следует применять более мощ­ные осветители и максимальный накал лампы.

Настройка темнопольного освещения в основном за­ключается в следующем:

1. устанавливают свет по Кёлеру; 2) заменяют светло­польный конденсор темнопольным; 3) на верхнюю линзу конденсора наносят иммерсионное масло или в крайнем случае дистиллированную воду; 4) поднимают конденсор до соприкосновения с нижней поверхностью предметного стекла; 5) объектив малого увеличения фокусируют на препарат; 6) с помощью центрировочных винтов переводят в центр поля зрения светлое пятно (иногда имеющее затемненный центральный участок); 7) поднимая и опуская конденсор, добиваются исчезновения затемненно­го центрального участка и получения равномерно освещен­ного светлого пятна. Если этого сделать не удается, то надо проверить толщину предметного стекла (обычно такое явление наблюдается при использовании слишком толстых предметных стекол — конус света фокусируется в толще стекла).

После правильной настройки света устанавливают объ­ектив нужного увеличения и исследуют препарат.

ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ (ФЛЮОРЕСЦЕНТНАЯ) МИКРОСКОПИЯ

Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия осно­вана на способности некоторых веществ люминесциро- вать, т. е. светиться при освещении невидимым ультрафи­олетовым или синим светом. Примером такого свечения являются известные всем лампы дневного света, в кото­рых в результате облучения ультрафиолетовыми лучами светится специальный состав—люминофор, покрыва­ющий изнутри колбу лампы.

Цвет люминесценции обычно смещен в более длинно­волновую часть спектра по сравнению с возбуждающим ее светом. Так, если люминесценция возбуждается синим светом, то цвет ее может быть от зеленого до красного, если люминесценция возбуждается невидимым ультрафи­олетовым излучением, то цвет ее может быть в любой части видимого спектра. Эта особенность люминесценции позволяет, используя специальные светофильтры, погло­щающие возбуждающий свет, наблюдать сравнительно слабое люминесцентное свечение.

Устройство люминесцентного микроскопа и правила работы с ним отличаются от обычного светового микро­скопа в основном следующим:

1. Наличие мощного источника света в осветителе, излучающего преимущественно в коротковолновой (уль­трафиолетовой, синей) части спектра (ртутно-кварцевая лампа сверхвысокого давления). В специальных люминес­центных осветителях, которые устанавливают на обычный микроскоп, применяют кварцевые галогенные лампы (КГМ).

2. Наличие системы светофильтров: а) возбуждающие светофильтры пропускают только ту часть спектра, кото­рая возбуждает люминесценцию;

б) теплозащитный светофильтр защищает от перег­рева другие светофильтры, препарат и оптику люминес­центного микроскопа. В отечественных люминесцентных микроскопах теплозащитную функцию кроме того выпол­няет кювета с плоскопараллельными стеклами, заполнен­ная дистиллированной водой. Эта кювета установлена непосредственно после коллектора.

При работе с люминесцентным микроскопом надо обращать особое внимание на то, чтобы эта кювета была полностью заполнена водой и чтобы вода была абсо­лютно чистой и прозрачной, поскольку при длитель­ной работе микроскопа в воде могут размножаться микро­организмы и она мутнеет;

в) «запирающие» светофильтры расположены между препаратом и окуляром. Эти светофильтры поглощают возбуждающее излучение и пропускают свет люминесцен­ции от препарата к глазу наблюдателя.

В нашей стране разработан очень эффективный способ освещения препаратов для возбуждения люминесценции, который используется во всех отечественных люминес­центных микроскопах. Этот способ заключается в том, что препарат освещают светом, падающим на него через объектив. Благодаря этому освещенность увеличивается при использовании объектов, имеющих большую число­вую апертуру, т. е. тех, которые используются для изучения микроорганизмов. Очень важную роль при этом способе освещения играет специальная интерференцион­ная светоделительная пластинка, направляющая свет в объектив и представляющая собой полупрозрачное зерка­ло, которое избирательно отражает и направляет в объек­тив только ту часть спектра, которая возбуждает люми­несценцию, а пропускает в окуляр только свет люминес­ценции.

Оптика объективов люминесцентного микроскопа изго­тавливается из нелюминесцирующих сортов оптического

стекла и склеивается специальным нелюминесцирующим клеем. На оправе таких объективов выгравирована буква «Л». При работе с объективами масляной иммерсии при люминесцентной микроскопии пользуются специальным нелюминесцирующим иммерсионным маслом.

Правила настройки люминесцентного микроскопа под­робно изложены в инструкции к микроскопу.

На рис. 3 показан люминесцентный микроскоп «Лю­мам», выпускаемый Ленинградским оптико-механическим объединением (ЛОМО).

Для изучения микроорганизмов в люминесцентном микроскопе их предварительно окрашивают (флюорохро- мируют) сильно разведенными растворами специальных люминесцирующих красителей (флюорохромов), которые избирательно связываются с определенными структурами клетки. Флюорохромы отличаются от обычных красите­лей тем, что применяются в очень малых концентрациях (до нескольких мкг/мл); кроме того, ими могут быть окрашены не только фиксированные, но и живые клетки. Люминесцентная микроскопия также используется для регистрации результатов

реакции иммунофлюоресценции (РИФ).