Методы микробиологического исследования

Микроскопический метод используется для изучения окрашенных мазков и мазков из нативного материала в микроскопе и позволяет характеризовать морфологию (форму) возбудителя, его отношение к различным краси­телям, подвижность. С помощью этого метода можно подтвердить клинический диагноз гонореи, дифтерии, воз­вратного тифа, сифилиса и некоторых других болезней.

Микроскоп и микроскопические методы исследования

Для обнаружения и исследования микроорганизмов применяют микроскопы. Световые микроскопы предназна­чены для изучения микроорганизмов, которые имеют размеры не менее 0,2 мкм (бактерии, простейшие и т. п.), а электронные—для изучения более мелких микроорга­низмов (вирусы).

Различают простые и сложные световые микроскопы. Оптика простых микроскопов представлена одной линзой с большим увеличением. В сложных микроскопах оптиче­ская система состоит из объектива для получения увели­ченного изображения объекта и окуляра для дальнейшего увеличения полученного изображения и его рассматри­вания.

Современные световые микроскопы, позволяющие не только увидеть микроорганизмы, но и изучить их структу­ру,— это сложные оптические приборы, обращение с которыми требует определенных знаний, навыков и боль­шой аккуратности.

Биологические световые микроскопы, в зависимости от области применения, сложности устройства и комплек­тации различной оптикой, подразделяются на рабочие, лабораторные и исследовательские. Сейчас наша промыш­ленность выпускает серию микроскопов «Биолам». Микро­скопы этой серии имеют обозначения, указывающие, к какой группе они относятся (Р — рабочие, JI—лаборатор­ные, И — исследовательские), комплектация обозначается цифрой, например рабочие от Р11 до Р17 .

В микроскопе различают механическую и оптическую части.

К механической части относится штатив (состоящий из основания и тубусодержателя) и укрепленные на нем тубус с револьвером для крепления и смены объективов, предметный столик для препарата, приспособления для крепления конденсора и светофильтров, встроенные в штатив механизмы для грубого (макромеханизм, макро­винт) и тонкого (микромеханизм, микровинт) перемещения предметного столика или тубусодержателя.

Оптическая часть микроскопа представлена объектива­ми, окулярами и осветительной системой, которая в свою очередь состоит из расположенных под предметным сто­ликом конденсора Аббе, зеркала, имеющего плоскую и вогнутую сторону, а также отдельного или встроенного осветителя с низковольтной лампой накаливания и тран­сформатором. Объективы ввинчиваются в револьвер, а соответствующий окуляр, через который наблюдают из­ображение, устанавливают с противоположной стороны тубуса.

Различают монокулярный (имеющий один окуляр) и бинокулярный (имеющий два одинаковых окуляра и да­ющий возможность наблюдения двумя глазами) тубусы. Кроме того, тубус микроскоп может быть прямой верти­кальный (в основном для фотографирования) и наклон­ный.

Виды микроскопирования фазово-контрастная микроскопия

Световые волны характеризуются длиной волны, ам­плитудой и фазой. Глаз человека способен различать длину волны (цвет) и амплитуду (интенсивность, яркость света), но не может обнаружить различия в фазе.

При микроскопии окрашенных объектов наблюдается изменение амплитуды (уменьшение яркости света) и изби­рательное поглощение света определенной длины волны (изменение цвета).

При наблюдении неокрашенных микрооорганизмов, от­личающихся от окружающей среды только по показателю преломления, изменения интенсивности не происходит, а изменяется только фаза прошедших световых волн. По­этому глаз изменений заметить не может и эти объекты выглядят малоконтрастными, прозрачными.

Для наблюдения таких объектов используют фазово­контрастную микроскопию, основанную на превращении фазовых изменений, вносимых объектом, в амплитудные, различимые глазом.

Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом биологическом микроскопе и состо­ит из: 1) набора объективов со специальными фазовыми пластинками; 2) конденсора с поворачивающимся диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответству­ющие фазовым пластинкам в каждом из объективов; 3) вспомогательного микроскопа.

Настройка фазового контраста в основном заключает­ся в следующем:

1. заменяют объективы и конденсор микроскопа на фазово-контрастные;

2. устанавливают объектив малого увеличения и отвер­стие в диске конденсора без кольцевой диафрагмы (обоз­наченное цифрой «О»);

3. настраивают свет по Кёлеру;

4. выбирают фазовый объектив соответствующего увеличения и фокусируют его на препарат;

5. поворачивают диск конденсора и устанавливают соответствующую объективу кольцевую диафрагму;

6. вынимают из тубуса окуляр и вставляют на его место вспомогательный микроскоп. Настраивают его так, чтобы были резко видны фазовая пластинка (в виде темного кольца) и кольцевая диафрагма (в виде светлого кольца того же диаметра). С помощью регулировочных винтов на конденсоре точно совмещают эти кольца. Вынимают вспомогательный микроскоп и вновь устанавли­вают окуляр.

Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст). Наша промышлен­ность выпускает устройство КФ-4 для позитивного фазо­вого контраста.

Фазово-контрастная микроскопия широко применяется также для изучения клеток культуры ткани, наблюдения действия различных вирусов на клетки и т. п. В этих случаях часто применяют биологические микроскопы с обратным расположением оптики — так называемые ин­вертированные микроскопы. У таких микроскопов объективы расположены снизу, а конденсор — сверху. Иногда они заключены в термостат для наблюдения за динамикой изменений и клетках культуры ткани и снабже­ны кинокамерой.

Морфология некоторых микроорганизмов не может быть изучена с помощью описанных выше способов микроскопии. К ним относятся различные спирохеты и, в частности, лептоспиры, некоторые крупные вирусы. Для наблюдения этих микроорганизмов применяют темнополь­ную микроскопию.