Количественные методы

Количественные методы имеют большое значение при проведении многих исследований, в том числе и фага. Врачу нужно знать активность фага, чтобы правильно установить его дозу при лечебно-профилактическом при­менении, исследователю — чтобы выяснить, как изменяет­ся активность фага в эксперименте.

Активность фага выражают понятием титр, различая титр фага в жидкой и на плотной среде.

При исследовании в жидкой среде (по Аппельману) титр фага — это наибольшее его разведение (или наименьшее количество), которое подавляет рост тест-культуры в условиях данного опыта.

На плотной среде (титрование по Грациа) титр фага — количество частиц (корпускул) фага в 1мл ис­ходного материала.

Титрование фага по Аппельману (в жидкой среде). При титровании фага объем и состав среды, температура, аэрация, количество микробов, пробирки, в которых про­водят титрование (диаметр, конфигурация дна, толщина стекла), должны быть одинаковыми. Изменяется только количество фага.

Все компоненты, участвующие в биологических опы­тах, подлежат обязательному контролю на правиль­ность их работы.

При титровании фага ставят контроль фага и бульона на стерильность, контроль культуры — на ее жизнеспособ­ность.

Постановка опыта. 1. В 12 стерильных пробирок наливают по 4,5 мл стерильного бульона. Уровень жидко­сти во всех пробирках должен быть одинаковым. Если это не так, значит допущена ошибка. В этом случае нестандартную пробирку заменяют новой и заново напол­няют бульоном. При разливе бульона пользуются пипет­ками вместимостью 5—10 мл.

Пробирки ставят в штатив и нумеруют от 1 до 10, на одной из оставшихся пробирок пишут «КК» (контроль культуры), на другой — «КФ» (контроль фага). Все про­бирки, в которых проводят опыт, должны быть надпи­саны.

В десяти пробирках готовят последовательные деся­тикратные разведения фага от 10 до 10^-10 . В 1-ю пробирку вносят 0,5 мл фага. Такое же количество вносят в пробирку контроля фага. Сменив пипетку, новой пипеткой тщательно перемешивают содержимое 1-й про­бирки и переносят 0,5 мл его во 2-ю пробирку; 0,5 мл содержимого 2-й пробирки переносят в 3-ю и так далее до 10-й пробирки, меняя каждый раз пипетки. Перемешав содержимое 10-й пробирки, 0,5 мл жидкости из нее выли­вают в дезинфицирующий раствор. Также поступают с содержимым пробирки контроля фага. Для разведения фага пользуются пипетками вместимостью 1—2 мл. Про­веряют уровень жидкости в пробирках. Он должен быть одинаковым.

Во все пробирки, кроме пробирки контроля фага, вносят по 1 капле (0,05 мл) взвеси тест-культуры. Пробирки встряхивают. Во всех пробирках, кроме пробир­ки контроля фага, должна появиться слегка заметная муть. Если этого не происходит, все операции с нестан­дартной пробиркой повторяют вновь.

Пробирки помещают в термостат на 18—20 ч, после чего учитывают результат титрования.

Учет результатов обязательно начинают с контролей.

При правильной постановке опыта в контроле культу­ры должно быть размножение бактерий—содержимое пробирки становится мутным. Этот контроль позволяет сделать вывод, что взятая в опыт культура жизнеспособна и что питательная среда обеспечивает ее развитие в данных условиях опыта. Значит, если в пробирках с фагом культура не выросла, на нее подействовал фаг.

Жидкость в пробирке с контролем фага должна остать­ся прозрачной. Этот контроль позволяет сделать вывод, что посуда, бульон и фаг стерильны.

При правильных результатах в контролях регистриру­ют характер изменений в первых десяти пробирках. Рост культуры в пробирках «опытного» ряда говорит об отсут­ствии или недостаточном количестве в них фага. Устанав­ливают титр фага, т. е. его наибольшее разведение, в котором произошел лизис культуры (содержимое пробир­ки прозрачно). Обозначают титр степенью разведения фага с обратным знаком, что соответствует порядковому номеру пробирки. Например, если культура не растет в первых семи пробирках, титр фага равен 10 ~⁷.

Титрование фага по Грация (на плотной среде) методом агаровых слоев позволяет определить количество частиц фага в титруемом материале. Метод основан на том, что каждая частица фага дает зону просветления (лизиса) на чашке с газоном чувствительного к нему микроба, т. е. образует отдельную колонию.

Постановка опыта. Чашки с 20—25 мл МПА покрывают сте­рильной фильтровальной бумагой и подсушивают в термостате или под бактерицидной лампой (расстояние от лампы не более 2 м). Титруемый фаг разводят от 10до 10 ~¹⁰ (как в предыдущем опыте) и по 1 мл переносят в другие пронумерованные пробирки (соответственно из 1-й в 1-ю и так далее до 10-й), в которые заранее наливают по 2,5 мл 0,7% МПА, расплавленного и остуженного до 45 °С. В каждую из этих пробирок добавляют по 0,1 мл тест-культуры. Содержимое пробирок быстро перемешивают (не дать застыть агару) и выливают на поверх­ность среды в чашки Петри с номерами, соответствующими номерам пробирок. Через 30 мин чашки ставят в термостат.

Учет результатов проводят через 18—20ч. При большой концентрации фага (в первых чашках) произойдет сплошной лизис культуры. В тех разведениях фага, в которых находилось небольшое количество частиц фага, появятся изолированные колонии, которые подсчитывают. Чтобы не ошибиться в счете, каждую учтенную колонию помечают со стороны дна чашки. Аппарат для счета колоний намного облегчает работу (см. рис. 54). Чтобы установить количество частиц фага в 1 мл фаголизата, пользуются формулой: п = ухх, где п—искомое число; у—количество выросших на чашке колоний фага; х—разведение фага в чашке, в которой подсчитаны колонии.

Например, если в чашке с разведением фага 10 ~⁸ (1:10⁸) выросло 25 колоний, то в 1 мл исходной жидкости содержится 25х10⁸ или 2,5х10⁹ частиц фага.

Более точные результаты получают, если определяют количество частиц фага в исходной жидкости по нескольким разведениям и вычисляют среднее арифметическое. Например, при разведении фага 10^_6 выросло₆ 320 колоний, следовательно, в 1 мл исходной жидкости было 320x10 или 3,2х10⁸ частиц фага. При разведении фага 10~⁷ выросло 42 колонии, следовательно, в исходной жидкости было 4,2х10⁸/мл частиц фага. При разведении фага 10 ^_8 выросло 5 колоний, следовательно, в исходной жидкости было 5х10⁸/мл частиц фага. Сложив величины, полученные при этих подсчетах и разделив сумму на 3 (количество проведенных подсчетов), устанавливают число частиц фага в 1 мл титруемого препарата. В нашем примере оно равно 4,1 х 10⁸.

Подсчитывать колонии лучше всего на чашках, где выросло не меньше 5 и не больше 50 колоний. В противном случае страдает точность подсчета. Если на чашке много колоний, чашку можно разделить на несколько секторов, сосчитать колонии на одном из них и полученную цифру умножить на количество секторов.

Как правило, все биологические исследования прово­дят в трех параллельных опытах. В данном примере каждое разведение фага одновременно титруют трижды.