Методы изучения вирулентных фагов

Подготовка материала

Материалом, из которого выделяют фаг, обычно явля­ются фильтраты, полученные с помощью бактериальных фильтров из объектов внешней среды, органов и выделе­ний человека и животных, культур микроорганизмов и т. д.

Перед фильтрацией исследуемый материал подготавливают следу­ющим образом:

Жидкости (кровь, мочу, воду, смывы с предметов и т. п.) освобожда­ют от крупных частиц с помощью бумажного фильтра или центрифуги­рованием, чтобы они не забили поры бактериального фильтра.

Вязкий материал (гной, кал) эмульгируют в изотоническом растворе натрия хлорида или бульоне, после чего освобождают от крупных частиц, как описано выше.

Плотный материал (кусочки органов, пищи и т. п.) предварительно измельчают — обычно растирают в ступке со стерильным кварцевым

песком. Вместо песка можно использовать стерильные кончики пасте­ровских пипеток или битые покровные стекла. Растертый материал тщательно эмульгируют в изотоническом растворе натрия хлорида или бульоне и освобождают от крупной взвеси.

Подготовленный материал пропускают через бактери­альный фильтр, освобождая от посторонней микрофлоры.

Культуры микроорганизмов (известные или изучаемые). В работе с фагом применяют 20—24-часовые культуры, выращенные на агаре, или 2 — 6- часовые культуры в жидких средах. Чистоту культуры устанавливают в маз­ках, окрашенных фуксином Пфейффера или по Граму. Из культур, выращенных на скошенном агаре, готовят взвесь. В пробирку с культурой наливают 3 — 5 мл изото­нического раствора натрия хлорида. Вращая пробирку между ладонями, осторожно смывают культуру с поверхности среды так, чтобы не намочить пробку. Взвесь переносят в стерильную пробирку и разводят изотониче­ским раствором натрия хлорида 1:10 (0,5 мл взвеси в 4,5 мл раствора).

При работе с фагом необходима стерильная посуда (градуированные и пастеровские пипетки, чашки Петри, пробирки, колбы, ступки), термостат, фильтровальное устройство, центрифуга, штативы, прибор для счета колоний.

Внимание! Вся работа с фагом требует соблюдения асептики.

Качественные методы

О наличии фага в том или ином субстрате узнают по лизису чувствительной к нему микробной культуры (тест- культура).

Обнаружение фага на плотных средах. Тест-культуру засевают «газоном» (см. главу 7) на поверхность агара в чашке Петри. Посев подсушивают в термостате 30— 40 мин при открытой крышке, после чего на него наносят каплю изучаемого материала. Через несколько минут, когда жидкость впитается, чашки помещают в термостат на 18 — 20 ч. Если в изучаемом материале есть фаг, произойдет лизис культуры и на месте, куда была нанесена капля, культура или совсем не вырастет (сплош­ной лизис) или образуются отдельные колонии фага.

Обнаружение фага в жидких средах. В две пробирки с одинаковым количеством бульона вносят по одной капле культуры микроба, в отношении которого изучают фаг. В одну из них добавляют исследуемый фаг или фильтрат материала, в котором его определяют. Вторая пробирка служит контролем роста культуры. Пробирки помещают в термостат на 12— 20 ч. Учет результатов производят только при наличии роста культуры в контроле (помутне­ние среды). Отсутствие видимого роста или последующее просветление среды в пробирке с исследуемым матери­алом свидетельствует о присутствии фага. Если содержи­мое этой пробирки мутное, исследование необходимо дополнить посевом на плотную среду: помутнение могло произойти от роста устойчивой к фагу культуры. Только в том случае, если в посеве на агар фаг не будет обнаружен, можно сделать вывод, что его нет в изучаемом мате­риале.