§ 8. Количественное определение токсических веществ, изолированных подкисленной водой или подкисленным спиртом

Количественное определение токсических веществ, выделенных из биологического материала, является заключительным этапом химико-токсикологического анализа. Количественное определение токсических веществ производится после их идентификации. При идентификации могут быть обнаружены токсические вещества, которые приняты умершим перед смертью в терапевтических дозах (с лечебной целью) и не были причиной отравления. Дозу яда, поступившего в организм, можно оценить только на основании результатов количественного определения.

В химико-токсикологическом анализе для количественного определения токсических веществ, выделенных из биологического материала и других объектов, применяются чувствительные фотоколориметрические, спектрофотометрические, газохроматографи-ческие и некоторые другие методы. Ввиду малой чувствительности гравиметрических и титримегрических методов они практически не применяются в химико-токсикологическом анализе. Выделенные из биологического материала вещества, которые подвергаются количественному определению, должны быть хорошо очищены от белковых соединений, продуктов их разложения, образующихся в трупном материале, и от других примесей.

Несмотря на большое значение результатов количественного определения ядовитых веществ, выделенных из биологического материала, для решения вопроса об отравлениях в ряде случаев результаты этих определений могут быть занижены. Это объясняется рядом причин.

Токсические вещества в организме в определенной степени подвергаются метаболизму. Вещества, вызвавшие отравление, неравномерно распределяются в органах и тканях организма. В одних органах эти вещества находятся в больших количествах, чем в других, а в некоторых органах и тканях эти вещества могут отсутствовать. Поэтому результаты химико-токсикологического анализа зависят от правильного выбора органов и тканей, направляемых на исследование. Ядовитые вещества в организме связываются с белковыми и другими соединениями. Количество выделяемых веществ, переходящих в вытяжки из биологического материала, зависит от применяемого метода выделения токсических веществ из соответствующих объектов. Количество токсических веществ, выделенных из биологического материала, зависит и от степени гнилостного разложения исследуемых объектов. Влияние указанных выше факторов на выделение токсических веществ необходимо учитывать при оценке результатов количественного определения ядов, выделенных из биологического материала в ходе химико-токсикологического анализа.

§ 9. Метод выделения токсических веществ, основанный на изолировании их этиловым спиртом подкисленным щавелевой кислотой

Первый метод выделения алкалоидов из биологического материала, основанный на изолировании этих веществ этиловым спиртом, подкисленным щавелевой кислотой, предложил Стас. Затем этот метод модифицировал Отто. В литературе описан ряд недостатков этого метода (см. § 1). Учитывая недостатки метода Стаса — Отто, он не применяется в современном химико-токсикологическом анализе, а применяется ряд модификаций указанного метода. Одна из них приводится ниже.

100 г тщательно измельченного биологического материала вносят в широкогорлую колбу вместимостью 500 мл, заливают этиловым (96°) спиртом до покрытия им твердых частиц исследуемого объекта. Смесь биологического материала и этилового спирта подкисляют 10 %-м спиртовым раствором щавелевой кислоты. Содержимое колбы периодически перемешивают стеклянной палочкой. Через некоторое время проверяют рН содержимого колбы и при необходимости прибавляют 10 %-й спиртовой раствор щавелевой кислоты до рН = 2...3.

Колбу слегка закрывают пробкой, оставляют на сутки в теплом месте (25—30 °С) при периодическом перемешивании ее содержимого. После этого кислую спиртовую вытяжку сливают с биологического материала. Настаивание биологического материала с новыми порциями этилового спирта, подкисленного 10%-м раствором щавелевой кислоты до рН = 2...3, производят еще 3—4 раза (в течение суток каждый раз).

Кислые спиртовые вытяжки из биологического материала соединяют и переносят в фарфоровую чашку. Биологический материал переносят на фильтр и промывают этиловым спиртом. Этиловый спирт, которым промывают биологический материал, присоединяют к полученным вытяжкам. Объединенные спиртовые вытяжки упаривают до густоты сиропа на водяной бане, нагретой до 40 °С. К сиропообразной жидкости при перемешивании стеклянной палочкой по каплям прибавляют этиловый спирт (96°) до прекращения выпадания примесей в осадок. Образовавшийся осадок отфильтровывают, фильтр промывают этиловым спиртом. Фильтрат снова упаривают на водяной бане до густоты сиропа, как указано выше. Из сиропообразного остатка примеси осаждают этиловым спиртом. Упаривание спиртовых фильтратов и осаждение примесей этиловым спиртом из сиропообразной жидкости проводят многократно (до прекращения осаждения примесей от прибавления этилового спирта).

К очищенной таким образом сиропообразной жидкости прибавляют 25 мл воды. Если при этом образуется осадок, его отфильтровывают.

Кислую водно-спиртовую жидкость переносят в делительную воронку, прибавляют 10—15 мл хлороформа и легко взбалтывают в течение 5 мин, а затем отделяют хлороформную вытяжку. Кислую водно-спиртовую жидкость еще 2—3 раза взбалтывают с новыми порциями хлороформа (по 10—15 мл). Хлороформные вытяжки из кислой водно-спиртовой жидкости соединяют и исследуют на наличие ядовитых соединений, экстрагирующихся органическими растворителями из кислой среды.

Оставшуюся в делительной воронке кислую жидкость подщелачивают 25 %-м раствором аммиака до рН = 9...10. Из этой подщелоченной жидкости алкалоиды и другие токсические вещества 3—4 раза экстрагируют новыми порциями хлороформа (по 10— 15 мл). Хлороформные вытяжки соединяют и исследуют на наличие алкалоидов и некоторых других токсических веществ основного характера.

Описанный выше метод выделения токсических веществ из биологического материала, основанный на изолировании их этиловым спиртом, подкисленным щавелевой кислотой, является трудоемким. Для выделения токсических веществ из биологического материала с помощью этого метода требуется 8—10 рабочих дней. На один анализ расходуется около 500 мл этилового спирта. В связи с большим количеством операций, связанных с осаждением примесей из вытяжек, в ходе химико-токсикологического анализа могут теряться определенные количества ядовитых веществ, адсорбирующихся примесями.

Несмотря на указанные выше недостатки метода изолирования токсических веществ подкисленным этиловым спиртом, этот метод является эффективным для выделения ядовитых соединений из гнилостного биологического материала.