Материал, методология и методики

1. Метилирование днк: методы исследования: общие сведения

На протяжении более 50 лет изучения феномена применялись разные методы, как количественной его оценки, так и статуса метилирования специфических участков генома. Суммарное содержание метилированного цитозина в ДНК оценивают после ее предварительного кислотного или ферментативного гидролиза. 5-Метилцитозин выявляют разными способами (одномерные или двумерные хроматография и электрофорез, газовая хроматография, масс- спектрометрия, HPLC) и измеряют его относительное содержание.

Конъюгаты 5-метилцитозина с сывороточным альбумином могут быть использованы для получения антител, которые эффективно (хотя и не абсолютно специфично) выявляют в ДНК малые количества этого модифицированного основания. 5-метилцитозин в ДНК выявляется секвенированием по Максама и Гилберту. Поскольку модифицированное основание в меньшей степени, чем цитозин или тимин, реагирует с гидразином, то в секвенирующем геле соответствующая полоса отсутствует. Подтверждение может быть получено секвенированием комплементарной нити.

Метилирование исследуется чувствительными к 5-mC рестриктазами. Используют рестрикционные эндонуклеазы, чувствительные и нечувствительные к метилированию остатков цитозина (такие, например, как пары НраII и MspI, SmaI и XmaI). В сочетании с гибридизацией методом Саузерна этот способ позволяет установить, метилирован ли сайт узнавания соответствующих рестриктаз. Применимость подхода ограничена тем, что набор соответствующих изошизомеров не покрывает всех CpG-динуклеотидов.

1.1 Выделение днк

Для выделения нуклеиновых кислот из биологических материалов необходимо провести лизис клетов, инактивацию клеточных нуклеаз и отделение искомых нуклеиновых кислот от клеточной массы. Часто идеальная процедура лизиса является компромиссом нескольких методик; она должна быть достаточно жёсткой, чтобы разрушить структуры сложного исходного материала (например, тканей), и при этом должна быть достаточно деликатной, чтобы оставить в неприксновенности целевые нуклеиновые кислоты. Обычная процедура лизиса включает:

• Механическое разрушение (например, измельчение, гипотонический лизис).

• Химическую обработку (например, лизис с помощью детергентов, хаотропных агентов, или тиоловое восстановление).

• Ферментативное расщепление белков (например, с помощью протеинкиназы К).

Процессы разрушения клеточных мембран и инактивации внутриклеточных нуклеаз могут быть совмещены. Например, один раствор может содержать детергенты для растворения клеточной мембраны и хаотропные соли для инактивации внутриклеточных ферментов. После лизиса клеток и инактивации нуклеаз, клеточная масса может быть легко удалена с помощью фильтрации или осаждения.

Методики очистки нуклеиновых кислот из клеточных экстрактов обычно являются комбинацией двух или боле из следующих методов:

• Выделение/осаждение.

• Хроматография.

• Центрифугирование.

• Аффинное разделение.

Выделение/осаждение часто используется для удаления примесей из нуклеиновых кислот. Применяется экстракция растворителями. Например, их комбинация: фенол-хлороформ часто используется для удаления белков. Осаждение изопропанолом или этанолом обычно применяется для концентрирования нуклеиновых кислот. Если содержание целевых нуклеиновх кислот небольшое, к смеси может быть добавлен инертный носитель (такой как гликоген) для того, чтобы увеличить эффективность преципитации. Другие методы осаждения нуклеиновых кислот включают селективную преципитацию с использованияем высоких концентраций солей («высаливание»), либо осаждение белков с использованием переменного рН.

Хроматографические методики могут использовать различные технологии разделения, такие как гель-фильтрация, ионообменная хроматография, селективная адсорбция, либо аффинное связывание.

Селективное центрифугирование является мощным методом, используемым для очистки. Например, ультрацентрифугирование в самоформирующихся градиентах хлористого цезия при больших ускорениях уже давно используется для очистки плазмид. Часто центрифугирование комбинируют с каким-либо другим методом. Например, клоночная хроматография при вращении, которая объединяет гель-фильтрацию и центрифугирование для очистки ДНК или РНК от низкомолекулярных примесей (солей, нуклеотидов и др.), для смены буфера или для селекции по размеру.

В последние годы всё больше методик очистки объединяют аффинную иммобилизацию нуклеиновых кислот с магнитным разделением. Например, poly (A) + мРНК может быть привязана к магнитным частицам, покрытым стрептавидином, с помощью меченных биотином олигонуклеотидов (oligo (dT)), после чего комплекс частиц может быть удалён из раствора (как и несвязанные примеси) с помощью магнита. Твёрдофазная техника упрощает очистку нуклеиновых кислот, так как способна заменить несколько этапов: центрифугирования, экстракции органическими растворителями и фазавого разделения, одним быстрым этапом магнитного разделения [12].

Пример методики выделения геномной ДНК из парафиновых блоков.

Все шаги, связанные с центрифугированием необходимо проводить при комнатной температуре (15–25°С).

До начала процедуры следует учесть следующие пункты:

1. Доводят все буферные растворы до комнатной температуры.

2. Устанавливают на термостате температуру в 56°С.

3. Если буфер AL и ATL содержат осадок его необходимо растворить нагреванием при температуре 70°С с последующим аккуратным перемешиванием.

4. Убеждаютя, что буфер AW1 и AW2 приготовлены для последующей работы согласно инструкции.

Методика выделения ДНК из парафиновых блоков:

1. Используют скальпель для удаления парафина с образцов.

2. Делают срезы толщиной 5–10 мм. Если поверхность образца соприкасается с воздухом первые 2–3 среза удаляются.

3. Незамедлительно помещают срезы в 1.5 или 2 мл эппендорфы и добавляют 1 мл ксилена к образцам. Закрывают крышечки эппендорфов и энергично вортексируют в течении 10 секунд.

4. Центрифугируют на максимальной скорости в течении 2 минут при комнатной температуре.

5. Удаляют супернатант, но не удаляют образовавшийся осадок.

6. Добавляют 1 мл этанола (96–100%) к осадку и перемешивают вортексированием. Этанол осаждает оставшийся ксилен с образца.

7. Центрифугируют на максимальной скорости в течении 2 минут при комнатной температуре.

8. Осторожно удаляют оставшийся этанол, используя новые наконечники.

9. Открывают эппендорфы и инкубируют при комнатной температуре (15–25°С) или до 37°С. Инкубируют в течении 10 минут или до того момента пока полностью не испарится оставшийся этанол.

10. Ресуспензируют осадок в 180 мкл буфера ATL. Добавить 20 мкл протеиназы К и перемешать вортексированием.

11. Инкубируют при 56°С в течении часа (или до того момента пока образец полностью не подвергнется лизису).

12. Инкубируют при 90°С в течении часа.

13. Центрифугируют эппендорфы для удаления капель с внутренней стороны крышечки.

14. Добавляют 200 мкл буфера AL к образцу и перемешивают вортексированием. Затем добавляют 200 мкл этанола (96–100%) и снова перемешивают вортексированием.

15. Центрифугируют эппендорфы для удаления капель с внутренней стороны крышечки.

16. Аккуратно переносят весь лизат на колонки не намочив края, закрывают крышечку и центрифугируют при 8000 об/мин. в течении одной минуты. Помещают колонки в чистые collection tube и удалить collection tube содержащие супернатант.

17. Аккуратно открывают колонки и добавляют 500 мкл буфера AW1 не намочив края. Закрывают крышечки и центрифугируют при 8000 об/мин. в течении одной минуты. Помещают колонки в чистые collection tube и удаляют collection tube содержащие супернатант.

18. Аккуратно открывают колонки и добавляют 500 мкл буфера AW2 не намачивая края. Закрывают крышечки и центрифугируют при 8000 об/мин. в течении одной минуты. Помещают колонки в чистые collection tube и удаляют collection tube содержащие супернатант.

19. Центрифугируют на максимальной скорости 14000 об/мин. в течении 3 минут для высушивания мембраны полностью.

20. Помещают колонки в чистые эппендорфы и удалить collection tube, содержащие супернатант. Аккуратно открывают крышечки колонок и наносят 20–100 мкл буфера ATE на центр мембраны.

21. Закрывают крышечки и инкубируют при комнатной температуре (15–25°С) в течение одной минуты. Центрифугируют на максимальной скорости (14000 об./мин.) в течение одной минуты.

Пример методики выделения геномной ДНК из цельной крови.

Выделение ДНК из цельной крови можно проводи такими способами: методом водно-метанольной экстракции и с помощью стандартной методики по протоколу «Литех» ("ДНК-ЭКСПРЕСС-кровь").

Последовательность выделения по методу водно-метанольной экстракции:

1. В стерильных условиях с помощью пинчера (диаметр 3 мм) вырезают диск из расчета один диск на 65 мкл конечного объёма;

2. Добавляют 125 мкл метанола (х.ч.д.а), инкубируют при комнатной температуре (+20^оС) в течение 10 минут при постоянном встряхивании (500-700/мин);

3. С помощью автоматического медицинского экстрактора отбирают метанол, дают высохнуть образцам естественным путём (20-25 минут) или центрифугируют в вакуумной центрифуге в течение 10 минут при 500 об/мин;

4. Добавляют 65 мкл бидистиллированной воды и проводят инкубацию в два этапа – 10 минут при +65^оС и еще 10 минут при +98^оС. Инкубируют при постоянном встряхивании в программируемом автошейкере HLC (BioTech, Германия);

5. После инкубирования центрифугируют в течение одной-двух минут при 100 об/мин. Образцы хранят при +4^оС. Несколько лучший «выход» ДНК имеет место в случае клеток, фиксированных на целлюлозном носителе, и наблюдается при дополнительной инкубации при комнатной температуре в течение 10-12 часов.

Стандартная методика выделения ДНК по протоколу «Литех» осуществляется с помощью тест-наборов «ДНК-экспресс-кита» и включает несколько этапов:

1. Пробирки с реагентом, содержащие анализируемый материал, тщательно встряхивают на микроцентрифуге-встряхивателе в течение 10 секунд, помещают пробирку в предварительно прогретый до +98^оС твердотельный термостат и инкубируют при температуре +98^оС в течение 10 минут;

2. После завершения инкубации пробирки центрифугируют при 12000 об/мин при комнатной температуре (+18-25^оС) в течение 15 сек; полученный супернатант используют в качестве исследуемого образца ДНК для постановки реакции амплификации. Его можно хранить при температуре +2-8^оС не более одной недели или при температуре -20^оС не более 6 месяцев.